Produção, caracterização e purificação parcial de L-Asparaginase por fungo endofítico utilizando farinha de Opuntia ficus-indica E Nopalea cochenillifera como substrato

Abstract

L-Asparaginase é uma enzima que apresenta importância para a indústria farmacêutica por sua aplicação no tratamento do câncer e na indústria alimentícia para reduzir a formação de acrilamida em alimentos. Os fungos endofíticos são potenciais produtores de moléculas bioativas, como a L-asparaginase. O objetivo do presente estudo foi produzir, caracterizar e purificar parcialmente a L-asparaginase sintetizada por fungo endofítico. Para isso, 17 fungos endofíticos foram avaliados quanto à capacidade de produzir a enzima por fermentação submersa. O isolado mais promissor foi testado quanto ao potencial enzimático intracelular e extracelular utilizando como substratos as farinhas de Opuntia ficus-indica e de Nopalea cochenillifera, como substitutas da L-prolina. A farinha selecionada foi utilizada nas etapas de análise dos perfis de crescimento e produção da enzima, e para otimizar a produção. Foram avaliados métodos de ruptura celular e extração da L-asparaginase. O extrato enzimático bruto obtido foi caracterizado quanto ao efeito do pH e temperatura para a atividade e estabilidade da enzima. A enzima foi parcialmente purificada utilizando as técnicas de precipitação com sulfato de amônia, ultrafiltração e cromatografia de troca aniônica. Os fungos Colletotrichum annellatum URM 8538 (0,74 U/g), Diaporthe ueckerae URM 8321 (0,87 U/g) e Penicillium decaturense URM 7966 (0,76 U/g) apresentaram potencial na produção de L-asparaginase. O isolado mais promissor, D. ueckerae URM 8321, produziu a enzima apenas na forma intracelular, utilizando as farinhas de O. ficus-indica (0,90 U/g) e de N. cochenillifera (0,72 U/g). O período de 120h foi ideal para produção tanto da biomassa (1,00 g/mL), quanto da enzima (1,00 U/g). Após a otimização parcial da produção enzimática foi observado um aumento de 46,11% (1,67 U/g) nas seguintes condições: concentração do inóculo de 1% e da farinha de O. ficus-indica de 0,2%, em pH inicial 4,0. O método de congelamento e trituração foi eficaz para extrair a enzima da biomassa fúngica. O extrato enzimático apresentou seu ótimo em pH 8,0 e a 60 °C, e demonstrou estabilidade maior que 70% frente aos pHs avaliados (3,0 – 10,0), durante 120 minutos, e permaneceu estável (100%) entre 20 °C e 50 °C, no mesmo período de tempo. Com a purificação parcial foi obtido um fator de purificação de 7,32 e rendimento de 47,87%. A L-asparaginase produzida por D. ueckerae URM 8321, utilizando substratos de baixo custo como a farinha de O. ficus-indica, apresenta atividade e estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura, tornando-a promissora para futuros estudos visando aprimorar seu potencial de aplicação na indústria.