Análise de dados de sequenciamento de amostras de ar coletadas utilizando drones

Abstract

Um microbioma é formado por comunidades de diversas espécies de microrganismos que coexistem e se relacionam. Estudos e a caracterização dessas comunidades microbianas de forma não enviesada podem ser estabelecidos através da metagenômica, que corresponde ao sequenciamento direto dos genomas de um determinado microbioma. A aplicação desta técnica é possível atualmente devido ao aprimoramento e a adesão das tecnologias de sequenciamento de DNA de alto rendimento (HTS). Umas das abordagens conhecidas dessa técnica é o sequenciamento de amplicon, que tem como base o sequenciamento de regiões conservadas e hipervariáveis presentes em genes marcadores, e.g. o gene que codifica a subunidade 16S do RNA ribossomal para avaliação de comunidades bacterianas. Em paralelo, as análises sobre a composição de microbiomas ambientais são majoritariamente realizadas em solo ou água, contudo o ar é um compartimento pouco explorado em virtude, principalmente, da dificuldade em realizar coletas. Considerando tal problemática, o presente trabalho apresentou o desenvolvimento de uma nova metodologia de coleta que consistiu em utilizar veículo aéreo não tripulado (VANT), de pequeno porte, popularmente conhecidos como drones, atrelado ao uso de coletores e posterior análise metagenômica utilizando o sequenciamento das regiões V3-V4 do gene 16S rRNA para avaliação das comunidades microbianas encontradas no distrito de Pirituba, Vitória de Santo Antão- PE. Após a coleta, o material foi extraído utilizando o protocolo de Fenol/Clorofórmio e o DNA foi amplificado para as regiões V3-V4 do gene do rRNA 16S através da PCR. Por último, foram construídas as bibliotecas de sequenciamento, que em seguida foram quantificadas com Qubit dsDNA HS e sequenciadas na plataforma Illumina Miseq. O pré-processamento das sequências foi realizado pela ferramenta fastp, no qual uma quantidade relevante de bases de baixa qualidade foi eliminada, posteriormente as sequências foram analisadas através do pipeline Ampliseq, disponibilizado pelo repositório nf-core, e também pelo pacote Phyloseq R. As etapas de análises percorridas pelo pipeline foram controle de qualidade de sequências, inferência de ASVs, classificação taxonômica e cálculo das diversidades alfa e beta. Contudo, após a etapa de inferência de ASVs identificou-se uma contaminação considerável dos controles negativos e a partir disso, o pacote Phyloseq R foi utilizado para atenuar a contaminação nas outras amostras e assim obter uma classificação taxonômica e cálculos de diversidade mais acurados. Das 2123 ASVs previamente identificadas, restaram 2108 ASVs após a descontaminação. Ao final, apesar das dificuldades de padronização da coleta, extração e sequenciamento, a metodologia empregada permitiu caracterizar a composição microbiana das amostras minimamente.