Avaliação da proteína recombinante Lbrm0750 de Leishmania (Viannia) braziliensis em ensaio de ELISA para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana

Abstract

A Leishmaniose Tegumentar (LT) é uma doença causada por diferentes espécies de protozoários do gênero Leishmania. Nas Américas, o Brasil apresenta a maior prevalência de casos, onde Pernambuco encontra-se como um dos estados endêmicos para a doença. A LT apresenta um amplo espectro clínico, histopatológico e imunológico. O diagnóstico é realizado mediante a associação de dados epidemiológicas, clínicos e laboratoriais, visto que não existe um teste considerado padrão ouro. Um dos testes mais utilizados na rotina clínica é o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). Entretanto, essa técnica pode apresentar limitações, principalmente relacionadas ao tipo de antígeno utilizado, dificultando a precisão do diagnóstico. Nesse cenário, uma possível solução é a aplicação de ferramentas de bioinformática. Essa abordagem é utilizada na busca por antígenos específicos de agentes infecciosos, com intuito de aperfeiçoar o desempenho dos métodos existentes. Assim, o objetivo do trabalho foi utilizar a proteína recombinante Lbrm0750 de Leishmania (Viannia) braziliensis, no ensaio de ELISA, visando aperfeiçoar o desempenho do teste, sobretudo a sensibilidade e especificidade, além de comparar o ensaio de ELISA, utilizando o extrato bruto de proteínas da L. (V.) braziliensis. Inicialmente, as condições para obtenção da proteína 0750 relacionadas ao sistema de expressão, temperatura ideal de cultivo, como também características de solubilidade, foram avaliadas. Em seguida, foi verificado que com a linhagem BL21 (DE3) pLysS a 30°C ocorreu uma melhor expressão da proteína 0750. Após os ajustes descritos, a proteína foi direcionada aos ensaios de ELISA. Para tal, amostras de pacientes portadores de LT ativa (N=50) com positividade confirmada por testes parasitológicos e/ou moleculares, bem como amostras de indivíduos saudáveis (N=28). Para os ensaios de ELISA, a proteína 0750 foi utilizada na concentração de 100ng e as amostras foram diluídas na condição de 1:200, já utilizando o extrato bruto como antígeno, foi utilizada a concentração de 500ng, e as amostras foram diluídas na condição de 1:450. Após essas etapas, foi avaliado que a proteína 0750 reagiu com 80% (40/50) das amostras de pacientes. Já com o extrato bruto, o resultado foi de 36% (18/50). A melhor sensibilidade (80%) obtida com a proteína 0750 pode estar relacionada à sua obtenção, visto que é derivada de regiões com maior número de epítopos específicos de célula B no proteoma de L. (V.) braziliensis. Por outro lado, avaliando o desempenho das moléculas com amostras de indivíduos saudáveis, a especificidade obtida com o antígeno bruto foi de 100%, enquanto a proteína 0750 apresentou 35,7%. Dessa forma, os resultados obtidos sugerem que embora sejam necessários ajustes na metodologia com a proteína 0750, sua utilização como antígeno parece promissora para identificação de pacientes portadores de LT em comparação a abordagem convencional do ensaio de ELISA indireto, utilizando o extrato bruto do parasito.