Identificação e caracterização de modificações póstraducionais em homólogos de fatores de iniciação da tradução em Leishmania sp

Abstract

A iniciação da tradução em eucariotos é um ponto crucial no processo de síntese protéica e de sua regulação. Nesta etapa atua o complexo heterotrimérico eIF4F (formado pelas subunidades eIF4E, eIF4G e eIF4A), que atua recrutando a subunidade ribossomal 40S para o mRNA, para iniciar a tradução. O reconhecimento dos mRNAs se dá pela ligação da subunidade eIF4E no cap presente na sua extremidade 5’, junto com a ligação da proteína de ligação ao poli-A (PABP), que interage diretamente com o eIF4G, na extremidade 3’ destes mesmos mRNAs. Vários homólogos destes fatores foram encontrados nos tripanosomatídeos, indicando uma complexidade na iniciação da tradução que pode estar associada aos ciclos de vida únicos destes parasitas. Destes, dois complexos eIF4F típicos foram caracterizados, baseados em dois homólogos de eIF4E denominados de EIF4E3 e EIF4E4. Neste trabalho, a análise da expressão destas duas proteínas em Leishmania amazonensis mostrou que ambas são alvos de modificações pós-traducionais, identificadas como fosforilação, gerando múltiplas isoformas. O padrão de expressão dos dois conjuntos de isoformas é alterado com a inibição do processamento de mRNAs e a inibição da tradução interfere especificamente com as isoformas do EIF4E3. Curvas de sincronização celular sugerem uma associação de isoformas específicas com o ciclo celular do parasita. Múltiplos eventos de fosforilação parecem agir, porém de forma diferenciada, sobre os dois homólogos eIF4E. Diferentemente do EIF4E4, o EIF4E3 possui diferenças de expressão entre espécies de Leishmania, com uma banda de maior peso molecular, típica de células estressadas, encontrada apenas em L. amazonensis. A análise da seqüência do gene EIF4E3 de três espécies de Leishmania mostrou que poucas mudanças de aminoácidos levam a diferenças marcantes de migração das respectivas proteínas em gel desnaturante. Ensaios de mutagênese, associados a expressão ectópica do EIF4E3 contendo um epítopo HA em células de Leishmania transfectadas, identificou a serina 75, exclusiva de L. amazonensis, como sítio responsável pela geração da isoforma específica desta espécie. Análises em gel bidimensional mostraram que esta isoforma não está associada a alterações no ponto isoelétrico, indicando que outro tipo de modificação, além das fosforilação, deve ter como alvo o EIF4E3. Experimentos de interação in vitro e in vivo demonstraram que os EIF4E3 e 4 interagem diferencialmente com homólogos de PABP e realizam outras interações conservadas em espécies de tripanosomatídeos. Os resultados obtidos neste trabalho indicam uma complexa regulação destes fatores, através de múltiplos sítios de fosforilação, provavelmente relacionada com o ciclo celular do parasita.