Revestimento de partículas ferromagnéticas com heparina e heparan sulfato e seu uso como matriz de afinidade para purificação de proteínas plasmáticas

Abstract

Métodos de separação por afinidade têm se revelado eficazes e econômicos. Eles se baseiam na formação de um complexo estabelecido entre duas biomoléculas afins a um suporte insolúvel em água. Lavagens iniciais deste compósito removem impurezas de sorte que em uma segunda etapa o complexo é desfeito, liberando a biomolécula de interesse mediante seu rompimento (força iônica, pH, etc.). Dentre os diferentes métodos, aqueles baseados em suportes magnéticos têm as vantagens de fácil síntese, manuseio e o derivado ser recuperado por meio de um campo magnético. Esta tese se postulou a revestir partícula magnéticas com heparina (HEP) e heparan sulfato (HS) uma vez que esses glicosaminoglicanos são muito negativamente carregados e formam complexos com proteínas, por exemplo, proteínas plasmáticas. Três tipos de materiais foram sintetizados: polietilenotereftalato magnetizado (mPET), magnetita (MAG) e magnetita revestida com polianilina (mPANI). Inicialmente, filmes de PET sofreram hidrazinólise e o pó PET-hidrazida obtido foi magnetizado pelo método de co-precipitação em solução de cloretos férrico e ferroso. A MAG foi sintetizada conforme descrito acima, porém, sem adição do PET, e posteriormente foi revestida com PANI (mPANI). HEP e HS foram ativados com carbodiimida e N-hidroxissuccinimida e incubados com os suportes para que ocorressem o revestimento das partículas, produzindo os seguintes derivados magnéticos: mPET-HEP; mPANI-HEP; MAG-HEP; mPET-HS e mPANI-HS. As amostras de mPET-HEP foram investigadas por análise elementar e espectroscopia de infravermelho. A composição centesimal delas mostrou um aumento na razão carbono : nitrogênio, presumindo ser devido à imobilização de heparina. O espectro de infravermelho do derivado contendo heparina apresentou bandas em 1653 cm-1 e 1547 cm-1, característicos da ligação amida, formada pela conjugação. O derivado mPANI imobilizou cerca de 37% da heparina ofertada, embora a magnetita pura (MAG) também tenha imobilizado, porém em menor grau. Todas estas matrizes demonstraram uma boa estabilidade em 10 ciclos consecutivos de reutilização mesmo após 2 anos estocadas a 4°C. Quanto ao HS, este foi covalentemente fixado às partículas mPANI e mPET em torno de 35 μg e 38,6 μg por mg de suporte respectivamente, no entanto também foi adsorvido (18μg/mg) sobre as partículas controle de MAG. Indícios do sucesso da imobilização nestes compósitos foram a demonstração de que a heparina fixava o corante azul de metileno e retardava o tempo de coagulação do plasma recalcificado quando em contato com estes suportes. Finalmente, todos os derivados magnéticos foram incubados com plasma humano e lavados posteriormente com gradientes de NaCl para liberar as proteínas fixadas e detectá-las a 280nm. Eletroforese destas proteínas revelaram bandas referentes à antitrombina (58kDa) e as suas dosagens nos plasmas e eluatos confirmaram a eficiência do método de separação. Nos derivados mPET-HS e mPANI-HS, além da antitrombina, importantes fatores da coagulação também foram observados na eletroforese e comprovada a sua separação através de testes de coagulação específicos. Portanto, os resultados mostraram que estes compósitos produzidos são promissores na purificação da antitrombina e outros fatores da coagulação presentes no plasma humano.