Caracterização funcional da proteína EIF4E5 de Leishmania infantum, um homólogo da proteína de ligação ao cap, investigando proteínas parceiras e o papel da fosforilação no controle da sua função

Abstract

A iniciação da tradução em eucariotos é um processo altamente regulado, no qual a proteína eIF4E desempenha papel essencial ao reconhecer a extremidade 5' do mRNA por meio de sua ligação à estrutura cap, possibilitando o recrutamento das subunidades ribossomais. No complexo eIF4F, eIF4E atua em associação com eIF4G e eIF4A, na regulação da síntese proteica. Em tripanosomatídeos, gêneros Trypanosoma e Leishmania, foram identificados múltiplos homólogos de eIF4E e eIF4G que formam complexos do tipo eIF4F funcionalmente distintos, porém ainda pouco caracterizados. Entre esses, destaca-se a proteína EIF4E5 de Leishmania infantum, cuja caracterização recente revelou interações com os parceiros EIF4G1, G1-IP, a proteína de ligação ao RNA G1-IP2 e as proteínas adaptadoras 14-3-3I/II, indicando a conservação de um subcomplexo previamente descrito em Trypanosoma brucei. A presença de quinases associadas, sugerem que a fosforilação pode modular a função do complexo. Foram identificados resíduos fosforilados exclusivos na região C-terminal do EIF4E5 em L. infantum, ausentes nos ortólogos de Trypanosoma, o que aponta para possíveis divergências entre os gêneros. Diante desse contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar a função do eIF4E5 em L. infantum, com ênfase na influência da fosforilação sobre suas interações com parceiros proteicos, além de identificar quinases associadas e mRNAs-alvo mediados pela G1- IP2, buscando compreender a dinâmica desse subcomplexo no parasita. Para isso, foram construídos plasmídeos contendo os genes de interesse, destinados à transfecção em células promastigotas de L. infantum, visando à superexpressão de proteínas fusionadas ao epítopo HA. As linhagens celulares foram empregadas nas análises de interação proteína-proteína, realizadas por imunoprecipitação seguida de espectrometria de massas. As abordagens foram aplicadas às variantes de EIF4E5 contendo mutações em sítios de fosforilação, às proteínas quinases (CRK3 e RDK2) e à G1-IP2. Adicionalmente, realizou-se o sequenciamento de mRNAs com o intuito de identificar transcritos associados à G1-IP2. A proteína EIF4E5 de Leishmania infantum foi então analisada quanto à influência da fosforilação em suas interações proteicas. Os resultados da comparação entre EIF4E5 selvagem e os mutantes que abolem (S→A) ou mimetizam (S→E) a fosforilação sugerem que esta modificação pode influenciar sua rede de interações proteicas. Foi visto que a posição do epítopo HA também influenciou de certa forma a coprecipitação de parceiros detectados. As análises de imunoprecipitação de CRK3 e RDK2 indicaram associações compatíveis com funções regulatórias no ciclo celular. A G1-IP2 apresentou interação com diversos transcritos, incluindo proteínas de ligação a RNA, quinases e proteínas hipotéticas, com sobreposição parcial entre os dados RNA-seq e espectrometria de massas, além de variação durante o ciclo celular nos perfis de 24h, 48h e 72h. Em resumo, esses achados ampliam o entendimento da regulação traducional em L. infantum e destacam a complexidade do controle pós-transcricional nesse parasita.