Construção de vetor de expressão para exposição de proteínas recombinantes fusionadas à proteína âncora GCW61 na superfície de Pichia pastoris

Abstract

A expressão de proteínas recombinantes em leveduras, como Pichia pastoris, apresenta vantagens biotecnológicas significativas devido à capacidade da levedura de realizar modificações pós-traducionais, possuir status de segurança biológica e apresentar alta eficiência na produção de proteínas. Uma estratégia eficiente para a aproveitamento dessas proteínas de interesse é o sistema de exibição na superfície celular (Cell Surface Display), que utiliza proteínas âncoras para fixar moléculas de interesse na parede da levedura. Nesse contexto, o objetivo geral deste trabalho foi a construção de um vetor de expressão contendo a âncora GCW61 para exposição de proteínas recombinantes na superfície de P. pastoris, para futuras análises de comparação da sua eficiência com uma âncora mais estabelecida, a α-aglutinina. Para o desenvolvimento do trabalho, foi realizada a extração do RNA total de P. pastoris GS115, conversão em cDNA e amplificação por PCR para o isolamento do gene GCW61. Posteriormente, foi construído um cassete de expressão no vetor pPGK∆3 contendo GCW61, vetor a ser comparado com o pPGK_Agα. O vetor foi inserido em células de Escherichia coli TOP 10 e foram selecionadas as colônias recombinantes a partir de resistência por antibiótico. Após confirmação da clonagem por PCR convencional, os vetores foram linearizados a partir de digestão para integração do cassete no genoma de P. pastoris, seguida de transformação da levedura. A seleção das linhagens recombinantes foi realizada a partir de cultivo contendo o antibiótico zeocina e a confirmação da inserção do cassete de expressão nas células de leveduras foi realizada por PCR. O cassete de expressão construído e integrado ao genoma de P. pastoris apresenta-se como uma ferramenta para estudos posteriores de expressão e ancoragem em levedura, permitindo a comparação entre as proteínas âncoras GCW61 e α-aglutinina, possibilitando uma nova plataforma de ancoragem e estabelecimento de novos parâmetros de eficiência para futuras aplicações biotecnológicas em exposição de proteínas.