Caracterização da interação de RNA helicases do tipo DEAD-box com proteínas parceiras e complexos do tipo eIF4F de iniciação da tradução em Trypanosoma brucei

Abstract

Em eucariotos, as RNA helicases do tipo DEAD-box desempenham diversos papéis ligados ao metabolismo dos RNAs, atuando desde o núcleo até o citoplasma, sendo fundamentais na tradução dos mRNAs, onde podem atuar na sua iniciação junto aos complexos do tipo eIF4F. Nos tripanosomatídeos, como Trypanosoma brucei, diversos destes complexos podem interagir com diferentes RNA helicases, o que pode levar a diferentes padrões de tradução. Nesses organismos, estudos identificaram que o complexo baseado nas subunidades EIF4E4/EIF4G3 interage especificamente com uma única RNA helicase, chamada EIF4AI, típico parceiro de complexos eIF4F em outros eucariotos. Resultados preliminares mostraram que outro complexo de tripanosomatídeos, o EIF4E3/EIF4G4, parece coprecipitar com as RNA helicases DED1-2 e DBP2B, enquanto o complexo EIF4E6/EIF4G5, pode ter interação com a helicase DHH1. Para confirmar essa hipótese, este trabalho buscou analisar as associações das três helicases citadas acima de T. brucei com complexos do tipo eIF4F, a partir de ensaios de imunoprecipitação, além de identificar outros possíveis parceiros funcionais que possam esclarecer o modo de ação destas proteínas. Para isso, genes codificadores destas helicases foram clonados em sistema induzível por tetraciclina e em seguida transfectados em células procíclicas de T. brucei. A expressão das respectivas proteínas, todas marcadas com o epítopo HA, foi avaliada com anticorpo anti-HA, seguida de preparação de lisados celulares para imunoprecipitaçao e identificação das proteínas coprecipitadas por espectrometria de massas. Os resultados mostram que estas RNA helicases são expressas durante a fase exponencial de crescimento do parasita e estão presentes em fração citoplasmática solúvel dos lisados. A identificação de polipeptídeos coprecipitados evidenciaram proteínas tais como subunidades de complexos do tipo eIF4F e outros fatores de iniciação da tradução. Entre esses fatores, as subunidades do complexo eIF3 mostram-se associadas as três RNA helicases investigadas. A DED1-2 coprecipitou com o EIF4E4/EIF4G3 e, adicionalmente apresentou um perfil de polipeptídeos associados com a regulação do metabolismo energético, sugerindo uma possível conexão com vias metabólicas do parasita. Por outro lado, a DHH1 não apenas coprecipitou com o EIF4E4/EIF4G3, mas também com o EIF4G4 e subunidades do complexo NOT de deadenilação, indicando um papel mais proeminente da DHH1 na regulação da tradução geral do parasita, principalmente através do controle de meia-vida de mRNAs. Em contrapartida, a DBP2B também coprecipitou o EIF4G4, mas também o EIF4E5 e EIF4E6, juntamente com proteínas parceiras como PARN-1, MTR4 e RBG2, sendo a primeira envolvida em processos de deadenilação de mRNAs, enquanto a segunda e a terceira com a maturação de rRNAs e montagem de ribossomo, respectivamente. Com isso, é possível que a DBP2B apresente função moonlighting, atuando tanto na tradução de mRNAs como em processos de degradação/maturação de mRNAs e rRNAs. Esses achados destacam as funções distintas dessas helicases, atuando na tradução e no metabolismo de RNAs, fornecendo novas informações e estabelecendo uma base para futuras pesquisas que busquem identificar alvos específicos na tradução do T. brucei, com intuito de utilizar como estratégia de combate a patologias causadas por esses e outros parasitas.