Aplicação de técnica molecular no desenvolvimento de teste para diagnóstico de tuberculose paucibacilar e na caracterização gonotípica do Mycobacterium tuberculosis

Abstract

A Tuberculose (TB) é uma patologia cujo diagnóstico precoce e tratamento adequado são essenciais para a eficácia dos programas públicos de controle da doença, os quais buscam curar os doentes e evitar a transmissão da doença. O diagnóstico laboratorial envolve a baciloscopia realizada com auxílio da coloração de Ziehl- Neelsen, uma metodologia rápida, barata e acessível, com uma sensibilidade de 104 bacilos/ml e a cultura que é mais sensível mas cujo resultado pode demorar entre 9 a 45 dias. Para o diagnóstico de tuberculose espera-se que as técnicas de amplificação genéticas melhorem a velocidade, sensibilidade e especificidade para a detecção de micobactérias. Neste sentido foram objetos deste estudo o desenvolvimento de uma técnica molecular para diagnóstico de tuberculose paucibacilar e a caracterização genotípica de isolados de Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Uma reação de heminested PCR voltada para o diagnóstico de tuberculose e utilizando como alvo, o marcador genético IS6110, foi elaborada a partir de criteriosa escolha de primers e condicões ideais de concentração dos primers e cloreto de magnésio e de temperaturas de anelamento. A sensibilidade da técnica foi de 30 fg e pode ser concluída em até 3 dias após a coleta de amostras biológicas para análise. Comparada com a PCR convencional, a heminested PCR aumenta a sensibilidade e especificidade, o que é importante, especialmente nas amostras biológicas paucibacilares. Os resultados da caracterização genotípica de 61 isolamentos de M.tb obtidos durante os anos de 2000 a 2002, possibilitaram através da técnica do Double Repetitive Elements-PCR (DREPCR) identificar cinco grupos de pacientes, designados I, II, III, IV e V com 4, 3, 6, 2 e 2 pacientes respectivamente, portadores de cepas com 100% de similaridade e apresentando respectivamente 5, 5, 1, 2 e 5 bandas na eletroforese em gel de agarose. As cepas com mesmo perfil de resistência a drogas apresentaram perfis genéticos distintos, exceto três do grupo I. A melhor correlação epidemiológica dos grupos foi a apresentada pelo grupo I. Três membros são da mesma familía, todos portadores de cepas resistentes a isoniazida e rifampicina. São três mulheres com diagnóstico de diabetes mellitus . O primeiro caso diagnosticado de TB nessas pacientes foi em 1999 e o segundo em 2000. O terceiro caso foi diagnosticado na filha desta última em 2002. O impacto da genotipagem nestes casos, foi a análise da dinâmica de transmissão e a imediata utilização de esquema terapêutico adequado para a filha, já que era conhecida a Artur Henrique Bach Diagnóstico e Genotipagem de M.tuberculosis resistência aos antimicrobianos de primeira escolha utilizados para o tratamento das outras duas pacientes