Investigação de mecanismos regulatórios do sistema CRISPR/Cas em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é um bacilo Gram-negativo, não fermentador, responsável por causar uma gama de infecções hospitalares, apresentando como característica sua multirresistência. Pertencente ao grupo de bactérias ESKAPE (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp.), esse microrganismo possui alta capacidade de adquirir resistência a várias classes de antimicrobianos e de formar biofilmes. O sistema CRISPR/Cas corresponde a uma maquinaria adaptativa de defesa aos procariotos, que fornece imunidade contra a invasão por elementos genéticos móveis (EGMs), a exemplo de bacteriófagos e plasmídeos. O seu funcionamento ocorre diante da incorporação de novas sequências espaçadoras, derivadas dos EGMs invasores, e posterior degradação de sequências correspondentes aos fragmentos adquiridos. Devido aos desafios para o combate das infecções por P. aeruginosa, é necessário o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. No entanto, para o desenvolvimento eficaz de tais métodos, é necessário compreender os mecanismos pelos quais as bactérias conseguem se proteger, tais como a detecção de Quorum sensing e o sistema CRISPR/Cas. O objetivo deste estudo é investigar mecanismos regulatórios do sistema CRISPR/Cas em isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa. Para isso, foram obtidos de trabalhos anteriores cinco isolados clínicos de P. aeruginosa portadores dos sistemas CRISPR/Cas tipos I-F e I-E em seus genomas. A técnica de RT-PCR foi utilizada para a avaliação qualitativa da expressão de genes relacionados aos sistemas CRISPR/Cas, Quorum sensing (QS) e ao mecanismo de produção de biofilme. Reações de PCR em Tempo Real (qPCR) foram realizadas para avaliar os níveis de expressão relativa dos referidos genes sob baixa e alta densidade, bem como na presença de autoindutores e inibidores de QS. A análise de dados foi determinada utilizando o método 2-ΔΔCт, e os testes estatísticos, T-Student e Anova, foram utilizados para avaliar a significância dos resultados. A análise qualitativa da expressão gênica demonstrou que os cinco isolados estão expresando todos os genes investigados. A análise da expressão relativa de genes relacionados aos sistemas CRISPR/Cas, QS e genes de ativação de biofilme, evidenciou nos cinco isolados estudados que esses mecanismos são preferencialmente ativos diante de um aumento populacional bacteriano. No entanto, o perfil da expressão de genes associados aos sistemas CRISPR/Cas e QS foi diverso entre os isolados, mas a maioria dos resultados indicam a atuação de autoindutores na regulação da expressão gênica. Diante disso, estudos adicionais são necessários para esclarecer a atuação dessas moléculas na regulação do sistema CRISPR/Cas em isolados clínicos de P. aeruginosa.