Caracterização biofísica e bioquímica de uma protease de Mucor subtilissimus UCP 1262 com atividade fibrinolítica para aplicação farmacêutica

Abstract

No setor biomédico, as proteases fibrinolíticas atuam diretamente no coágulo de fibrina ou como ativadoras do fibrinogênio e são capazes de manter o fluxo sanguíneo. Fungos filamentosos, especialmente Mucor subtilissimus, destacam-se na produção de protease com atividade fibrinolítica, sendo vantajosos por seu fácil cultivo, resistência ao estresse e alto rendimento enzimático. Esta tese tem como objetivo a caracterização e aplicação de protease fibrinolítica produzidas por Mucor subtilissimus. O primeiro capítulo revisa narrativamente o uso de enzimas fibrinolíticas no tratamento da trombose. Descrevendo a importância da realização de estudos sobre doenças cardiovasculares, especialmente a trombose, as diversas abordagens utilizadas e as vantagens do uso de enzimas fibrinolíticas, bem como seus principais mecanismos de ação. O segundo capítulo revisa sistematicamente a produção de proteases fibrinolíticas por fungos, analisando a literatura recente sobre métodos de produção, purificação e caracterização. A pesquisa foi conduzida nas bases ScienceDirect, PubMed e Scopus, utilizando como palavras-chave “(Fibrinolytic enzyme) OR (Fibrinolytic protease) AND (Fungal or Fungus or Fungi)”, delimitando período de 10 anos. Os resultados obtidos foram filtrados por critérios de seleção, sendo excluídos artigos de revisão e artigos fora do escopo do trabalho, os selecionados foram avaliados e pontuados segundo critérios pré-estabelecidos. Dentre os 21 artigos selecionados foram descritos 12 gêneros diferentes e o uso de fermentação submersa e a purificação de Serino proteases foram mais descritos. O capítulo também enfatiza uma maior representação de etapas de purificação e caracterização, indicando a necessidade de atenção ao cultivo e aplicação enzimática. O segundo capítulo realiza caracterização da protease fibrinolítica de Mucor subtilissimus (MsFE), avaliando suas propriedades físico-químicas, impacto da radiação gama na atividade e estrutura, e análise de atividade fibrinogenolítica. As investigações incluíram: atividade fibrinogenolítica, efeitos de solventes e íons, raios gama, vida útil da enzima, espectroscopia no infravermelho (FTIR), CD, determinação de tempos de coagulação e cinética enzimática. Os principais resultados obtidos mostram que a protease manteve 90% de atividade em solventes orgânicos, o FTIR indicou grupos funcionais carbonila, ligações C=C em aneis aromáticos, aminas e haletos orgânicos, estudos espectroscópicos de dicroísmo circular indicaram que a estrutura secundária (folha β) da enzima permaneceu principalmente inalterada em pH 2.0–9.0, enquanto mudanças consideráveis foram observadas na estrutura terciária. A análise cinética revelou parâmetros alterados após a irradiação, inicialmente aumentou a atividade da enzima, mas diminuiu progressivamente além de 20 kGy, e íons metálicos, especialmente magnésio, aumentaram a atividade da enzima irradiada. Esses achados ressaltam a importância da enzima como alternativa na formulação de biofarmacos a serem empregados na indústria farmacêutica e biomédica. Este estudo destaca o potencial da radiação gama como um modulador para aprimorar a atividade fibrinolítica, sugerindo futuras aplicações biomédicas.