Produção e ensaio pré-clínico de vacina contra o Sars-CoV-2 utilizando a levedura Pichia Pastoris como carreadora da proteína Spike

Abstract

A proteína Spike do SARS-CoV-2 permite o ingresso do vírus na célula pela sua interação com o receptor ECA-2, sendo o principal alvo para a produção de modelos vacinais. As vacinas da Moderna (RNAm-1273), Pfizer-BioNTech, AstraZeneca (AZD1222), da Johnson & Johnson (Ad26.COV-2-S) e da “NuvaxovidTM” (NVX-CoV2373) utilizam a proteína Spike para a ativação da resposta imune tanto celular como humoral contra o SARS-CoV-2. Dentre as plataformas vacinais (Ácidos Nucleicos, VLP, Vetores Virais, Proteínas Recombinantes), o uso de leveduras como modelo vacinal, possibilita manter as modificações pós-traducionais das proteínas heterólogas, e quando usadas como modelo vacinal em animais, leva à ativação da resposta imune com produção de anticorpos neutralizantes. As ferramentas moleculares permitem, nas leveduras, a ancoragem das proteínas na porção externa da parede celular, facilitando a interação do antígeno com as células imunológicas e direcionando a resposta na produção de linfócitos CD4+ e CD8+ ativos, além da produção de anticorpos específicos contra o patógeno-alvo. O presente estudo propõe o uso da P. pastoris GS115 expressando a proteína Spike ancorada na parede como um novo modelo vacinal contra o SARS-CoV- 2. Foi utilizado o vetor de expressão pPGK∆3-αAG para clonagem do gene Spike. A partir dos clones confirmados, o DNA plasmidial obtido foi tratado com SacI e logo inserido na levedura por eletroporação. As leveduras recombinantes foram cultivadas em meio YPD para a confirmação da proteína Spike pelo método de Western Blot, e a confirmação da ancoragem por Yeast-ELISA. A vacinação dos camundongos com 1x108 células de P. pastoris-Spike, permitiu avaliar a segurança das leveduras e a resposta imunológica. Após a confirmação da ancoragem da proteína Spike pelo Yeast-ELISA e a vacinação dos camundongos com a levedura recombinante, os ensaios imunológicos in vivo demonstraram a ativação e a produção de linfócitos CD4+ ativos contra o SARS-CoV2 em modelo murino. A linfopenia em pacientes adoecidos pela COVID-19 e a diminuição dos linfócitos T CD4+/CD45, compromete a resposta imune adaptativa. Neste estudo, identificamos a presença dos linfócitos CD4+/CD45 que são importantes na manutenção da ativação da resposta dos linfócitos B e T direcionados ao antígeno. Os anticorpos neutralizantes achados após a vacinação, são gerados não só pela presença do RBD, mas também do NTD, e dos epítopos lineais S15P5 e S21P2 presentes na proteína Spike, tornado a Spike um promissor antígeno vacinal. A estratégia vacinal utilizada permitiu a ancoragem da proteína Spike na parede da P. pastoris GS115 e quando utilizada como modelo vacinal induziu de forma segura a estimulação do sistema imune, direcionando a resposta na produção de linfócitos T CD4+/CD45+ e anticorpos neutralizantes contra o SARS-CoV-2.