Isolamento e caracterização do inibidor de Tripsina de folhas de Cissus sicyoides (insulina vegetal) e seus efeitos citotóxicos e imunomodulador

Abstract

Cissus sicyoides L., família Vitaceae é uma trepadeira tropical americana que possui diversas propriedades medicinais, sendo seu uso como antidiabético e anti-inflamatório os mais conhecidos. A família Vitaceae está entre as maiores fontes de inibidores de proteases vegetais, classe de proteína que vem ganhando destaque em pesquisas por suas aplicações biotecnológicas, como por exemplo na imunomodulação. Este trabalho descreve a purificação e caracterização de um inibidor de tripsina obtido de folhas de C. sicyoides (CsFTI) e a avaliação de sua toxicidade e sua atividade imunomoduladora. O extrato proteico das folhas de C. sicyoides (EPFCs) foi obtido por homogeneização do pó das folhas secas em Tris-HCl (pH 10) 10%, p/v, por 16 horas a 25 °C. Para obtenção do inibidor, EPFCs foi aplicado em cromatografia de afinidade (Tripsina-Agarose). EPFCs e o CsFTI foram avaliados quanto a sua homogeneidade por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições desnaturantes (SDS), e ainda, o CsFTI foi submetido a uma eletroforese bidimensional para verificar seu ponto isoelétrico e sua subunidade foi avaliada por espectroscopia de massa e comparada com outras proteínas disponíveis em banco de dados. Outros parâmetros como quantificação proteica e atividade inibitória de tripsina foram realizados. Além disso, a análise fitoquímica do EPFCs foi realizada por cromatografia em camada delgada. A estabilidade na inibição de tripsina por CsFTI foi avaliada em diferentes condições de temperatura (30-100 °C) e pH (2,0- 10,0). O EPFCs e CsFTI foram avaliados quanto à atividade hemolítica (25-2000 e 25-1000 μg/mL) com eritrócitos humanos e sua capacidade de promover necrose em células mononucleares de sangue periférico (PBMC) (1,6–100 μg/mL). A atividade imunomoduladora de CsFTI e EPFCs sobre PBMCs foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas (TNF-α, IFN- γ, IL-2, IL4, IL-6, IL-10, IL-17). A avaliação para detecção de metabólitos secundários por TLC não revelou nenhum metabólito secundário no EPFCs. O EPFCs apresentou três bandas com aproximadamente 44,7 kDa, 37,8 kDa e 14,3 kDa, CsFTI (14,3 kDa) apresentou atividade inibitória de tripsina específica de 5.208 U/mg, ponto isoelétrico na faixa ácida (5,3) e ainda se apresentou como uma proteína termo-ácido estável. CsFTI mostrou homologia com uma endoquitinase encontrada nas folhas de Vitis vinífera, também da família Vitaceae. O CsFTI apresentou uma baixa toxicidade (7%) frente a PBMCs, apenas na maior concentração testada (100 μg/mL), e ainda apresentou significativa atividade hemolítica (EC50 = 33 μg /mL). O padrão de imunomodulação foi similar para EPFCs e o CsFTI, onde ambos estimularam a liberação de IL-4, IL-6, IL-10 e TNF- α. A liberação de IFN-γ, IL-2 e IL-17 não foi alterada por EPFCs e CsFTI nas concentrações testadas. Em conclusão, de forma pioneira, foi isolado um peptídeo de baixo peso molecular, de natureza ácida e com alta atividade inibitória de tripsina obtido das folhas de C. sicyoides. Ainda, CsFTI exibiu uma atividade imunomoduladora, capaz de estimular citocinas anti-inflamatórias e uma alta liberação de TNF- α também foi observada.