Avaliação de métodos de imobilização de sondas de DNA em plataformas biossensoras para identificação do DENV-3

Abstract

Nos últimos anos, o vírus da dengue 3 (DENV3) reapareceu no cenário epidemiológico trazendo preocupação aos profissionais da saúde devido à falta de um método de diagnóstico específico, portátil, de baixo custo e fácil manuseio, que permita a rapidez na identificação e no fornecimento do tratamento imediato para os infectados. Sendo assim, é de suma importância o desenvolvimento de uma plataforma biossensora através da imobilização de uma sonda de DNA, que ofereça sensibilidade e especificidade para a identificação do alvo. Com o intuito de construir um biossensor com uma sonda de DENV-3 imobilizada covalentemente em sua superfície, foi incorporado um filme polimérico de glutationa na superfície do eletrodo serigrafado de carbono produzido manualmente. Em sequência, foram testadas duas metodologias de bioconjugação para formação da ligação covalente da fita simples de DNA (ssDNA) do DENV-3 com o eletrodo modificado com o polímero. Em uma das metodologias foi utilizada a combinação do N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida (EDC) com o N-Hidroxissuccinimida (NHS) e na outra, foi utilizado o cloreto de 4-(4,6-dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il)-4-metil-morfolínio (DMTMM). Ambas as substâncias permitiram uma ligação covalente entre a extremidade carboxílica da glutationa, e a extremidade aminada da ssDNA. As análises executadas permitiram a definição de parâmetros, como velocidade de 50 mV/s e o uso de PBS pH 8,0, para a construção do filme polimérico no eletrodo. A avaliação de variáveis, como tempo e concentração, permitiram a padronização de fatores como 10 minutos e 5 mM/8 mM para o EDC/NHS, 16 horas e 2,5% para o DMTMM, permitindo a ligação mais forte entre as moléculas. Assim, a análise comparativa entre ambos os ativadores foi realizada através da interpretação das respostas na caracterização através da Voltametria de Pulso Diferencial (DPV). A leitura da oxidação do azul de metileno (MB) demonstrou a formação da ligação covalente da ssDNA na superfície modificada com ambos os ativadores, mas apresentou especificidade após a hibridização dos alvos apenas no biossensor com o EDC/NHS. Através desse estudo foi possível nortear futuros trabalhos, que contribuam para o desenvolvimento de um dispositivo rápido, específico e point-of-care para a detecção da DENV-3.