Avaliação IN Vitro de células natural killer, T E de um esferóide dérmico na Leishmaniose cutânea

Abstract

A Leishmaniose Cutânea (LC) é um problema de saúde pública caracterizada pelo surgimento de lesões com aspecto nódulo-crostoso. O curso da infecção na LC está estritamente relacionado a resposta imune do hospedeiro. As células natural killer (NK), são conhecidas pela sua capacidade de matar células infectadas, além de serem fortes produtoras de citocinas, como interferon-γ (IFN-γ), auxiliando no recrutamento e ativação de outras células. Os linfócitos T fazem parte da resposta imune adaptativa e são responsáveis pela resposta celular. Embora haja avanços nos estudos in vitro na LC, o mesmo apresenta diversas limitações, como a não semelhança com o ambiente in vivo. Pensando nisso, as culturas 3D tem sido fortemente recomendadas, visto que há uma mimetização da geometria, ambientação e sinalização entre as células. Porém, até o momento, não se tem relatos da utilização desta técnica para estudos na LC. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo avaliar as células Natural Killer e T em pacientes com lesão ativa da leishmaniose cutânea e desenvolver e testar um modelo de esferóide dérmico murino imunocompetente para estudos com a Leishmania spp. Fizeram parte do estudo trinta pacientes, sendo 23 pacientes AT e 7 pacientes PT. Além disso, tivemos um terceiro grupo composto por indivíduos saudáveis, denominado controle (CT), formado por 17 pessoas. Foram realizados estudos de imunofenotipagem e dosagem de citocinas a partir de sobrenadante de cultura das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Observamos uma menor percentual de células NK e de células NKT duplo- negativas (DN) nos pacientes com lesão ativa, enquanto, as células NKT CD4+ apresentaram um maior percentual nesta população. Não foi observada diferença significativa no percentual dos linfócitos T CD4+, CD8+ e DN. Além disso, observamos uma maior expressão de PD-1, Granzima b, TIGIT e CLTA-4 tanto nas células NK, quanto nos linfócitos T dos pacientes. Também foi observada a produção significativa de IL-2, IL-4. IL-6, IL-10, IL-17, IFN-γ e TNF nos pacientes com lesão ativa e após o tratamento, após estimulação com antígeno de L. braziliensis. Nos estudos em 3D, fibroblastos e macrófagos murinos foram cultivados e para a formação dos esferóides, foi utilizada a técnica de magnetização. Os esferóides formados foram avaliados quanto a sua formação/compactação, análises histológicas e avaliação da carga parasitária por meio de qPCR. Observamos sua formação e compactação após 24 horas de cultivo. Além disso, observamos que a proporção 8 fibroblastos: 1 macrófago apresentou melhor compactação e por isso foi escolhida para os demais experimentos. Na avaliação da carga parasitária, foi possível observar que houve infecção do modelo sendo possível detectar kDNA do parasito por meio da qPCR, revelando que o modelo pode ser promissor e utilizado para estudos na interação parasito-hospedeiro. Desse modo, o entendimento da resposta imune e da relação parasito-hospedeiro na LC é fundamental para o desenvolvimento de novas estratégias profiláticas e vacinais. Além disso, o desenvolvimento de modelos in vitro que se assemelhem aos eventos que ocorrem no in vivo podem contribuir para o entendimento da doença.