Análise metabonômica para discriminação de pacientes com varicocele quanto sua fertilidade usando dados clínicos e cromatografia a líquido

Abstract

A varicocele é uma doença caracterizada pela dilatação abnormal e tortuosidade na veia espermática, sendo a principal causa de infertilidade entre homens. A relação entre a varicocele e a infertilidade ainda não é bem definida. Além disso, o diagnóstico de infertili- dade também é muito demorado, podendo chegar a 1 ano, e impreciso. Nesse âmbito, um estudo metabonômico pode oferecer mais pistas sobre a relação entre a varicocele, infer- tilidade e parâmetros seminais. A primeira etapa de um estudo metabonômico envolve o preparo do material biológico para as análises químicas, onde são necessárias técnicas que extraiam o máximo de informação mesmo em pequenas quantidades, como o QuEChERS miniaturizado e o DLLME. Assim, como a diversidade de metabólitos alcançadas pode ser muito vasta, o uso de técnicas cromatográficas de separação e análise tornam-se cruciais. Quando se pensa em um estudo metabonômico com objetivo de identificar, classificar e diagnosticar indivíduos, é importante que a instrumentação seja acessível para hospitais e clínicas de médio e pequeno porte, como o HPLC-DAD, que é de fácil operação, robusto, reprodutível e de baixo custo. As amostras de sêmen foram coletadas e divididas em três classes: controle (C), varicocele fértil (VF) e varicocele infértil (VI). O preparo de amostra deu-se por Microextração Líquido-líquido dispersiva (DLLME) e QuEChERS. A otimização do estudo metabonômico foi realizado em um HPLC-DAD utilizando acetoni- trila e metanol. Definidas as melhores condições, as amostras foram submetidas a análise multivariada exploratória e classificatórias de dados através do software MATLAB, uti- lizando o somatório dos comprimentos de onda (de 200 a 400 nm) e a absorção apenas em 210 nm. Os dados clínicos foram colhidos de acordo com os parâmetros da OMS. A inserção dos dados faltantes foi efetuada com os algoritmos de SVD, KNN, BPCA e subs- tituição pela média dos valores observados. A qualidade da inserção foi feita através do teste de Kolmogorov-Smirnov. As mesmas análises quimiométricas foram realizadas com os dados clínicos. A otimização revelou que o melhor preparo de amostra foi o DLLME e a melhor fase móvel foi o MeOH. A análise por PCA robusta não indicou a presença de amostras anômalas, mas também não foi capaz de promover uma separação visual entre as classes. Já a análise por PLS-DA conseguiu promover uma separação melhor entre as classes, com exatidão de 95% e 75 % para o somatório e em 210 nm, respectivamente. Já a análise por LDA com seleção de variáveis apresentou exatidão de 80% para ambas as classes. Na tentativa de melhorar os resultados, foram construídos modelos utilizando apenas as classes VF e VI, onde a LDA atingiu 100% de classificação correta em todos os dados avaliados. Em relação aos dados clínicos, o modelo de KNN foi o que apresentou os melhores resultados segundo o teste de Kolmogorov-Smirnov. Também não foi verificado aqui a presença de amostras anômalas. A análise exploratória indicou que os parâmetros seminais e hormonais são explicam as principais diferenças entre as classes VF e VI. Os modelos classificatórios obtiveram acurácia de 77,5% e 87,5% para o PLS e LDA, res- pectivamente. Assim, os estudos apresentados aqui, apesar de preliminares, apresentam elevado potencial para funcionarem como triagem para o diagnóstico de infertilidade em homens com varicocele.