Purificação, caracterização e atividade imunomoduladora de uma lectina da semente da Castanha-da-índia (Aesculus hippocastanum L.)

Abstract

A busca por agentes biológicos com capacidade imunomoduladora visa fornecer resposta terapêutica para diversas doenças. Nesse contexto, as lectinas (proteínas que se ligam a carboidratos) apresentam elevado potencial imunomodulador, devido a sua capacidade de modular células imunológicas através da interação com proteínas de superfície gerando uma cascata de sinalização. A Aesculus hippocastanum, conhecida como castanheira-da-índia, é comumente utilizada para produção de fitoterápicos com atividades anti-inflamatória e vasoprotetora. O objetivo desse trabalho foi purificar e caracterizar uma lectina das sementes de A. hippocastanum (AhSL) e avaliar a sua citoxicidade e efeito imunomodulador sobre esplenócitos de camundongo. A farinha das sementes foi submetida à extração (10%, p/v) de proteínas em NaCl 0,15 M e o extrato foi submetido à cromatografia em coluna de DEAE Sephadex equilibrada com tampão Tris-HCl 0,1 M pH 8,0. As proteínas adsorvidas foram eluídas com o mesmo tampão, porém contendo NaCl 1,0 M, dialisadas e avaliadas quanto às atividades hemaglutinante (AH) e inibidora de tripsina (AIT). Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) foi realizada para avaliar a homogeneidade e a composição em subunidades de AhSL. A especificidade de ligação a carboidratos, o efeito de cátions divalentes na AH e a estabilidade da AH frente ao aquecimento (30–100°C) e após incubação em diferentes valores de pH (1,0–9,0) também foram avaliadas. Análises fluorimétricas tabém foram realizadas. Os esplenócitos de camundongo BALB/c foram tratados com AhSL (3,12– 50,00 μg/mL) e foi avaliada a ocorrência de apoptose e/ou necrose. A atividade imunomoduladora de AhSL (12,5 µg/mL) foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas e óxido nítrico (NO). AhSL (fator de purificação: 68,8) mostrou uma única banda polipeptídica em PAGE para proteínas ácidas e duas bandas polipeptídicas de aproximadamente 68 e 124 kDa em SDS-PAGE. Sua AH foi inibida por monossacarídeos, dissacarídeos e glicoproteínas, principalmente o acido n-acetilneuroaminico. A AH foi estável após o aquecimento em todas as temperaturas e incubação na faixa de pH 4,0–8,0 e sua atividade específica não foi alterada por nenhum cátion testado. Análise fluorimétrica revelou que a conformação da lectina não foi alterada após aquecimento a 100 ºC e incubação em diferentes valores de pH. AhSL também mostrou AIT específica de 1.280,31 U/mg. A lectina não foi tóxica para os esplenócitos e induziu a liberação de interleucinas 10 e 6, fator de necrose tumoral α e óxido nítrico, por fim a lectina não induziu despolarização de membrana mitocondrial e não aumentou os níveis de EROs citsólica ou mitocondrial. Em conclusão, uma proteína multifuncional (com atividades lectínica, inibidora de tripsina e imunomoduladora) foi purificada a partir de sementes de A. hippocastamum.