Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose

Abstract

Desenvolvimento de bioconjugados constituídos por pontos quânticos e a lectina ligadora de manose Pontos quânticos (PQs) se tornaram valiosas ferramentas para diversos estudos biológicos devido às suas propriedades únicas, como a alta fotoestabilidade, e por apresentar uma superfície quimicamente ativa que possibilita sua conjugação a biomoléculas, como lectinas. Conjugados de PQ-lectinas têm sido utilizados como sondas versáteis não só para o estudo do papel dessas biomoléculas como também para avaliar o perfil de carboidratos em diferentes sistemas biológicos, fornecendo valiosas informações a respeito da sua glicobiologia. A lectina ligadora de manose (MBL) é uma molécula que atua no sistema imune inato reconhecendo carboidratos como N-acetil-D-glicosamina, D-manose e L-fucose expressos nas superfícies de patógenos, e participa de processos biológicos, tais como ativação do complemento, opsonização, modulação da inflamação e depuração de células apoptóticas. Assim, este trabalho objetivou desenvolver um conjugado eficiente e específico constituído por MBL e PQs de CdTe. Para tanto, a adsorção – em vários pHs – e a ligação covalente em pH 6,0 foram avaliadas como estratégias de conjugação, sendo as leveduras de Candida albicans utilizadas como prova de conceito. Na conjugação foi utilizada uma MBL recombinante (rhMBL). Os resultados de citometria de fluxo evidenciaram que o conjugado preparado por adsorção em pH 6,0 foi o que marcou mais efetivamente as leveduras, apresentando a maior porcentagem e maior mediana de fluorescência, e, por isso foi escolhido para ser caracterizado quanto à especificidade e às propriedades ópticas. A especificidade foi analisada a partir de ensaios de inibição do conjugado pelo açúcar D-(+)-manose na presença de cálcio (sistema 1), com incubações sem a adição de cálcio (sistema 2), bem como com solução contendo o quelante EDTA (sistema 3). A caracterização óptica indicou que o conjugado escolhido apresentou com intensa fluorescência. Os resultados de citometria de fluxo confirmaram que esta nanossonda (adsorção em pH 6,0) foi capaz de marcar praticamente 100% das leveduras. Essa marcação reduziu para cerca de 15,1% para o sistema 1 e para 13,8% para o sistema 2, enquanto para o sistema 3, a marcação das células não foi praticamente observada, sendo menor que 1%. Esses dados evidenciaram que o conjugado foi específico e que a presença do cálcio foi fundamental para a rhMBL reconhecer as leveduras pelo domínio de reconhecimento de carboidratos. A análise por microscopia de fluorescência confirmou a eficiência do conjugado escolhido, revelando uma marcação homogênea da C. albicans. Assim, o conjugado de PQs-rhMBL, por adsorção em pH 6,0, pode ser considerado uma versátil e promissora ferramenta óptica para a compreensão do papel da MBL em diversos sistemas biológicos.