Clonagem molecular e expressão em Pichia pastoris do gene L1 de papilomavírus bovino tipo 2

Abstract

Os papilomavírus são um grupo de pequenos vírus DNA dupla fita caracterizado por induzir a formação de lesões que, normalmente, são benignas e podem regredir naturalmente, mas também apresentam opotencial para se tornarem tumores malignos. O papilomavírus humano (HPV) está fortemente relacionado às doenças sexualmente transmissíveis (DST) e é uma das principais causas de câncer cervical. O papilomavírus bovino (BPV), por sua vez, representa um grave problema econômico em termos de pecuária. Em bovinos, são mais comuns as papilomatosescutânease mucosas nas regiões genital e orofaríngea. Existem bem caracterizados seis tipos diferentes de BPV (BPV 1 ao 6) e, recentemente, quatro novos tipos (BPVs 7 ao 10) foram seqüenciados. No Nordeste, especialmente no estado de Pernambuco (Zona da Mata), a incidência da papilomatose bovina é muito alta, causando grandes perdas econômicas para os criadores. Não há tratamento com eficácia comprovada. Proteção contra a infecção é conferida por anticorpos neutralizantes dirigidos contra osepítopos conformacionais de proteínas estruturais L1. Esses anticorpos podem ser eficientemente induzidos pela imunização com virus-like particles(VLP) que se formam espontaneamente, após a expressão de L1 em sistemas heterólogos. Nos últimos anos, a levedura metilotrófica Pichia pastoris emergiu como um sistema eficaz e barato para produzir altos níveis deproteínarecombinante. O foco deste trabalho foi construir e avaliar dois plasmídeos (pPICZAαL1B2 e pPICZAL1B2), como vetores para expressão do geneL1BPV-2 em células de P. pastoris. Um deles (pPICZAαL1B2) insere na proteína recombinante um sinal de secreção (α-mating). Assim, esperou-se comparar a eficiência da expressão heteróloga através das viasintra e extracelulares. O gene L1 foi amplificado por PCR do genoma completo BPV-2, foi clonado em vetor pGEM-T(Promega ®) e, posteriormente, foi subclonado nos vetores de expressão pPICZA e pPICZAα (Invitrogen ®). PCR e análise de restrição indicarama inserção correta do gene L1 em ambos os vetores, bem como o seqüenciamento. Por eletroporação, P. pastoris (cepa de levedura X-33) foi transformada com a construção pPICZAL1B2 ou pPICZAαL1B2, cuja integração no genoma de levedura pode ser identificada por PCR da colônia. As leveduras transformadas foram selecionadas para experimentos de cultura com indução com metanol. A expressão de L1 foi indicada por RT-PCR e análise de proteínas. A proteína recombinante L1foi detectada em células de levedura, que sofreram tratamento com solução de lise (via intracelular) e em meio de cultura submetido a precipitação com acetona (via extracelular). Este estudo fornece um caminho para uma estratégia de vacina com VLP contra papilomaviroses bovina e apresenta um modelo experimental para estudos de papilomatosessimilares, além de mostrar um modelo experimental interessante para futuras aplicações em seres humanos.