Isolamento de inibidor de Tripsina e Proteína Anticoagulante da Hemolinfa de Lasiodora sp (aranha caranguejeira)

Abstract

Inibidores de protease são moléculas que têm a capacidade de controlar proteases por bloqueio da atividade catalítica. As proteases participam de importantes eventos fisiológicos tais como a digestão dos alimentos, coagulação sangüínea, e apoptose. A ação dos inibidores é essencial para garantir a homeostase. Artrópodes como insetos e aracnídeos são ricas fontes desses inibidores. O objetivo desse trabalho foi isolar inibidores de proteases presentes na hemolinfa da aranha Lasiodora sp. Hemolinfa foi coletada através de punção cardíaca na presença de anticoagulante. Após centrifugação (800g) o plasma foi separado e utilizado para a detecção de inibidor de tripsina, trombina, fator Xa e XIIa. Cromatografia de afinidade em tripsina-Sepharose resultou no inibidor purificado, porém sem atividade inibitória. Isolamento do inibidor de tripsina foi realizado por cromatografia em coluna de Sephadex G-100 e a preparação contendo atividade inibitória de tripsina foi denominada: inibidor de tripsina bruto. Cromatografia em Mono Q isolou a partir do inibidor de tripsina bruto, o inibidor de tripsina LPTI (do inglês Lasiodora plasma trypsin inhibitor) e uma proteína anticoagulante LPA (do inglês Lasiodora plasma anti-coagulant). Eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de sulfato sódico de dodecila revelou massa molecular de 72 kDa para LPTI e LPA. Avaliação de atividade inibitória sobre proteases e do efeito na coagulação através de determinação do tempo de recalcificação, tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) revelou que LPTI não interfere na coagulação e LPA, sem atividade inibitória de tripsina, interfere no TTPA. De acordo com nosso conhecimento LPTI e LPA correspondem ao primeiro inibidor de tripsina e a primeira proteína anticoagulante isolados da hemolinfa de aranha. LPTI e LPA podem participar no mecanismo de coagulação da hemolinfa através do controle da produção da protease fenoloxidase, que dispara a cascata, e do controle da atividade de proteases da cascata de coagulação