Paramyxovírus ofídio isolado de Crotalus durissus terrificus: padronização do método de PCR randômica para sequenciamento genômico e sequenciamento genômico parcial

Abstract

O paramyxovírus ofídio (OPMV) Brasil foi isolado em cultivo de células Vero, a partir de amostras coletadas do fluido pulmonar de serpentes Crotalus durissus terrificus. Estas apresentavam sinais de pneumonia, enquanto eram mantidas no Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos, Botucatu, São Paulo, Brasil. Amostras do OPMV Brasil purificado por ultracentrifugação em gradiente de sacarose foram inicialmente submetidas a alguns tratamentos no intuito de eliminar possíveis ácidos nucléicos contaminantes. Com o objetivo de realizar o sequenciamento do seu genoma, foi padronizada a técnica de PCR randômica. Através desta técnica foram obtidos seis fragmentos que representam proteínas de nucleocapsídeo, fosfoproteína, fusão e polimerase viral, variando entre 413 a 553 pb, exibindo identidade entre 82% a 89% com a espécie tipo dos paramyxovírus de répteis, o Fer-de-Lance vírus (FDLV - AY141760). Com base nestas informações outros primers foram desenhados e mais um fragmento com 670 pb foi sequenciado, o qual corresponde ao gene U com 85% de identidade com o FDLV. Juntamente com outras sequências obtidas por PCR para os genes HN, F e L, bem como uma sequência parcial para o gene F publicada por outros pesquisadores (AF251500) foram montadas sequências contíguas utilizando o software MEGA v4.0, as quais foram alinhadas e comparadas através do BLASTn contra os dados depositados no GenBank. Ao todo foram obtidos 10 fragmentos genômicos do OPMV Brasil, 3 fragmentos por PCR tradicional, 6 por PCR randômica e 1 por primer walking. Cerca de 5313 nucleotídeos foram sequenciados, ou seja, um terço do genoma se comparado com 15378 pb do FDLV. Não foram obtidas sequências apenas para o gene M (matrix). As sequências de aminoácidos apresentaram identidade entre 77% e 97% com o FDLV e as sequências de aminoácidos de 4 fragmentos foram homólogas aos domínios conservados das proteínas N, F, HN e L. Quando comparadas as sequências para o gene F obtidas durante esta pesquisa com a depositada no GenBank sob número de acesso AF251500, constatou-se 100% de similaridade entre 328 nucleotídeos comuns, cerca de 109 aminoácidos. Portanto sugere-se que, em 2001, o mesmo agente viral afetou, no mesmo período, as serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus em diferentes regiões do estado de São Paulo. Baseado nas comparações das sequências de aminoácidos com o FDLV, OPMV Brasil pode ser considerado uma espécie diferente. Contudo, é necessário identificar as relações filogenéticas do OPMV Brasil com outras espécies de paramyxovírus isoladas até o momento