Panteteinases de Culex quinquefasciatus: padrão de transcrição e detecção em larvas suscetíveis e resistentes ao larvicida Lysinibacillus sphaericus

Abstract

Larvicidas à base de Lysinibacillus sphaericus são usados no controle de Culex quinquefasciatus, cujo principal fator inseticida é a protoxina Binária (Bin). A resistência à Bin já foi registrada e está associada à ausência do seu receptor, a alfa-glicosidase Cqm1, e ao respectivo perfil de repressão do transcrito cqm1 que codifica o receptor em larvas resistentes. Análises transcriptômicas de larvas resistentes revelaram que o transcrito que codifica a proteína panteteinase (CPIJ017593) está mais reprimido do que o transcrito cqm1, sugerindo um possível envolvimento da panteteinase na ação da toxina Bin. A identificação de novos mecanismos de resistência é fundamental para o controle eficaz de vetores, visto que o conhecimento de múltiplos marcadores moleculares permite uma monitorização mais precisa da resistência em campo. Sendo assim, este trabalho visou determinar e comparar o perfil de transcrição dos genes da panteteinase e do cqm1 em larvas e adultos de colônias suscetíveis (S) e resistentes (R), avaliar a capacidade de dois anticorpos no reconhecimento da proteína recombinante e investigar a expressão de panteteinases em amostras de microvilosidades intestinais (BBMF) de larvas S e R. Os perfis de transcrição foram avaliados por qRT-PCR, utilizando primers específicos, e o reconhecimento das panteteinases recombinantes e nativas por Western-Blot com anticorpos policlonais anti peptídeos imunogênicos da panteteinases (anti-LKR e anti-CPE). A análise da quantificação relativa (Rq) de transcritos mostraram que larvas S apresentaram ampla variação na transcrição da panteteinase (Rq= 2,65 ± 3,33), enquanto larvas R mostraram repressão significativa (Rq= 0,34 ± 0,28). Em adultos (S e R), o perfil de transcrição foi semelhante entre os grupos, e independentemente do sexo. O perfil de transcrição do gene cqm1 mostra um padrão de repressão em larvas R (Rq= 0,41 ± 0,25) comparado às S (Rq=1,54 ± 1,15), mantendo esse padrão na fase adulta. A avaliação dos anticorpos anti-peptídeos da panteteinase mostrou que ambos reconhecem a panteteinase recombinante com peso esperado de 70 kDa com sensibilidade e especificidade, e o anticorpo anti-LKR teve um melhor desempenho. Em amostras de BBMF de larvas S, proteínas com peso aparente de 70 kDa, correspondente a panteteinase, foi especificamente reconhecida, enquanto que o anticorpo não reconheceu uma banda equivalente em amostras de larvas R. O conjunto de dados reforça que a repressão da panteteinase está relacionada ao fenótipo de resistência à Bin, e sugere que este gene pode ser um segundo marcador da resistência além do gene cqm1, que confere este fenótipo, assim como os resultados sugerem que a panteteinase pode ser uma proteína de membrana, podendo participar do mecanismo de resistência. Este é o primeiro estudo de identificação de uma panteteinase em mosquito, e a compreensão deste mecanismo favorece o desenvolvimento de novas ferramentas de controle vetorial.