Estratégias cromatográficas para recuperação dos marcadores das folhas de Eugenia uniflora, obtenção de complexos de inclusão com ciclodextrinas e avaliação das atividades anti-candida

Abstract

A cromatografia preparativa é utilizada para recuperar constituintes de matrizes vegetais, possibilitando a elucidação estrutural e investigação de atividades farmacológicas, especialmente relacionadas a polifenóis. A concentração de marcadores polifenólicos em extratos de folhas de Eugenia uniflora apresenta correlação positiva com atividades antifúngicas. Devido à complexidade da matriz vegetal, várias etapas e técnicas de cromatografia são combinadas. Após a recuperação, os constituintes podem apresentar características físico-químicas que interferem nas propriedades biológicas testadas, sendo a formação de complexos de inclusão (CI) com ciclodextrinas (CD) uma estratégia para superar essas dificuldades. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi desenvolver metodologias cromatográficas para o isolamento dos marcadores das folhas de E. uniflora, obter CI com CD e avaliar as atividades antifúngicas contra Candida spp. Os marcadores Ácido Gálico (AG), Miricitrina (MIR) e Ácido Elágico (AE) foram obtidos a partir do processamento da Fração Acetato de Etila (FAE) por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (CET) e Cromatografia Flash em fase reversa (CF) e caracterizados por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE-DAD) e espectrometria de massas (ESI-MS/MS). Os CI foram obtidos com os AG, MIR e AE e as βCD, hidroxipropil-βCD (HP-βCD) e γCD e caracterizados quanto a morfologia e propriedades térmicas. Além disso, as possíveis interações espaciais envolvidas na formação dos complexos foram previstas por ancoragem molecular. As atividades frente as cepas de Candida spp. foram testadas com o Extrato Bruto (EB), frações, subfrações, isolados e CI. Através da utilização da CET em gel de Sephadex® LH-20, foram obtidos cerca de 23,57% (p/p) da subfração rica em MIR e AG (subfração de flavonoides [FrFlav]) e 2,7% (p/p) da subfração rica em AE (últimas subfrações [UFr]). 62,67% (p/p) da FrFlav correspondeu a FrMIR e, a partir desta, foram recuperados até 93,89% (p/p) de MIR purificada. Ainda, no processamento da FrFlav também foram obtidos a FrAG e o AG purificado com rendimentos de até 35,75 e 58,12% (p/p), respectivamente. A partir da UFr, cerca de 3,52 e 67,86% (p/p) de FrAE e AE purificado foram recuperados, respectivamente. O AG (7,51 min), MIR (21,99 min) e AE (23,52 min) apresentaram purezas de pico de 99,9, 99,9 e 94,2% e massas desprotonadas de 169.0142, 463.0876 e 300.9988 m/z, respectivamente. Acerca dos CI, na ancoragem molecular, pôde-se notar que os marcadores apresentaram maior afinidade com o hospedeiro HP-βCD, quando comparados a β-CD e γ- CD. As alterações morfológicas e alterações no perfil de degradação térmica das estruturas isoladas e CI sugerem a provável formação dos complexos de inclusão, no entanto, mais ensaios térmicos e de espectroscopia para completa caracterização. A FrFlav e a UFr demonstraram os melhores resultados antifúngicos, com valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) entre 62,50 e 500 μg/mL. Os polifenóis quando avaliados individualmente, apresentaram valores maiores de CIM e Concentração Fungicida Mínima (CFM) se comparados as suas respectivas subfrações. As combinações também não demonstraram efeitos aditivos ou sinérgicos de atividade. Os achados demonstram que, apesar das concentrações dos marcadores majoritários apresentarem correlação com uma melhor resposta antifúngica, eles agem de forma conjunta com os outros compostos presentes no fitocomplexo e mais informações acerca da caracterização dos demais constituintes são necessárias. Os CI não apresentaram resultados antifúngicos superiores quando comparados aos isolados. Neste estudo, as estratégias desenvolvidas foram efetivas na recuperação dos marcadores majoritários das folhas de E. uniflora, também sugeridos como prováveis responsáveis pela ação antifúngica da espécie.