Desenvolvimento de genossensor eletroquímico para o diagnóstico rápido de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

A TB é a segunda doença infecciosa que mais leva à morte no mundo, mesmo que seja considerada uma condição tratável. Um dos fatores limitantes principais para o controle da epidemia, especialmente em países vulneráveis socioeconomicamente, é o diagnóstico. Os principais métodos diagnósticos: PCR, pesquisa sorológica e baciloscopia apresentam problemas de especificidade, são demorados e caros, além de exigirem mão de obra qualificada e estrutura laboratorial sofisticada. Na luz dessa problemática, considera-se então um método de diagnóstico rápido, barato e eficaz: os biossensores. Um passo vital no desenvolvimento destes dispositivos é a bioconjugação do biorreceptor na superfície de maneira estável. Assim, a escolha do biorreceptor também deve ser muito cuidadosa. O gene Rv2341 é um excelente candidato, com o potencial de superar vários marcadores utilizados atualmente para a detecção de TB. Está presente nas cepas de MT registradas no banco de dados NCBI (The National Center for Biotechnology Information) e até agora não ocorreu expressão gênica do mesmo em outros microrganismos não relacionados, atestando a especificidade do mesmo. Ademais, o sistema não se tornará supérfluo ao longo dos anos, já que o gene se encontra numa região estável que provavelmente estará presente nas próximas mutações das cepas de TB. A partir da sequência deste gene, foi sintetizada uma sonda aminada de DNA para imobilização na superfície do eletrodo. Para a construção do sistema foram confeccionados eletrodos de carbono serigrafados com um eletrodo de trabalho (WE) e um contra eletrodo (CE) feitos de pasta de carbono e eletrodo de referência (RE) de Ag/AgCl. Para a ligação covalente, foi gerado, por eletropolimerização, um filme de ácido glutâmico na superfície, com o intuito de fornecer os grupos carboxílicos (COOH) exigidos para formar a ligação com os grupos amina (-NH2) presentes na sonda de DNA. O agente bioconjugador DMTMM (4-(4,6-Dimetoxi-1,3,5-triazin-2-il) foi utilizado por ser capaz de potencializar a formação de ligações amida em meio neutro. Enfim, foi possível desenvolver um dispositivo que consegue diferenciar entre a sequência complementar da TB e uma sequência não complementar em meio sintético. Também foi possível caracterizar o sistema e comprovar o sucesso de cada etapa de modificação do sistema através de voltametria de pulso diferencial, espectroscopia de impedância eletroquímica e espectroscopia no infravermelho médio por transformada de Fourier. O desenvolvimento deste biossensor será um aliado importantíssimo no diagnóstico da TB, tanto no Brasil, com a possível implementação deste método do SUS, quanto em outros países que ainda são gravemente afetados por epidemias da doença.