Expressão e purificação de proteínas ribossomais de Leishmania spp

Abstract

Os tripanosomatídeos são uma família de protozoários responsáveis por causar doenças que infectam tanto animais como seres humanos. Essa família inclui o gênero Leishmania, parasita com formas de vida tanto intracelular como extracelular com morfologia dependendo do seu ciclo de vida. Essas variações morfológicas costumam ser reguladas pela produção de proteínas que podem ser usadas como marcadores específicos do parasita. Esse trabalho tem como objetivo a produção e purificação de duas proteínas responsáveis pelo crescimento celular. Essas proteínas, S6 e L23A, são proteínas ribossomais presentes nas subunidades 40s e 60s do ribossomo, respectivamente, estando associadas ao crescimento exponencial do parasita e podendo ser avaliadas como promissores marcadores. Como objetivos, buscou-se realizar a clonagem, expressão e purificação das proteínas S6 e L23A de L. infantum. Os genes codificantes das proteínas de interesse foram amplificados por PCR a partir do genoma de L. Infantum e clonados no vetor pGEM-T Easy em etapa prévia. Neste trabalho, estas construções foram utilizadas para subclonagem no vetor de expressão pET21A e tiveram sua integridade confirmada pelo sequenciamento genético. Foram realizadas otimizações das expressões das proteínas S6 e L23A em diferentes temperaturas. Também foram realizados testes de solubilidade em ureia das proteínas, importante passo na purificação que se seguiu. Esta foi realizada através de cromatografia de afinidade. A eficiência da purificação foi comprovada por ensaio de fracionamento no qual as proteínas purificadas foram visualizadas. A partir deste trabalho de purificação das duas proteínas aqui estudadas, estudos futuros utilizarão essas proteínas para realizar a imunização em coelhos com o objetivo final de obtenção de anticorpos contra as proteínas alvos que serão então utilizados na avaliação da sua expressão em diferentes fases de Leishmania spp.