Aplicação de Sm1-7qPCR PARA DETECÇÃO DE DNA DE Schistosoma mansoni em modelo murino com infecção controlada

Abstract

A esquistossomose é uma parasitose ocasionada pelo trematódeo Schistosoma spp., sendo a espécie S. mansoni prevalente no Brasil. O diagnóstico “padrão-ouro” para a doença é o teste parasitológico de Kato-Katz (KK), que identifica infectados e sua carga parasitária, porém apresenta pouca sensibilidade em áreas de baixa endemicidade. Por isso, o grande problema no contexto da saúde pública é a carência de métodos diagnósticos sensíveis que identifiquem pacientes assintomáticos e falso-negativos. Diante disso, a reação em cadeia de polimerase em tempo real (qPCR) pode ser promissora nessas localidades, devido à alta sensibilidade para detecção de pequenas quantidades de material genético. Para tanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a aplicabilidade da Sm1-7qPCR na detecção de DNA de Schistosoma mansoni em amostras de camundongos. Assim, foram recolhidas individualmente, após 42 dias de infecção, as fezes de 15 camundongos expostos à infecção por S. mansoni e de 15 camundongos não infectados, estabelecidos como “não expostos”. As 30 amostras foram submetidas às técnicas de Hoffman e KK, e também foram utilizadas para comparação de dois métodos de extração de DNA: o kit comercial QIAamp Power Fecal® e o método in house de fenol:clorofórmio (FC); as análises das extrações de DNA foram realizadas por meio da absorbância A260/280, pelo espectrofotômetro. Além disso, foram realizadas diluições seriadas em fator 10 de DNA de vermes de S. mansoni para aplicação no sistema Sm1-7qPCR, a fim de se obter a sensibilidade analítica da técnica. O sistema de qPCR otimizado e a Nested-PCR foram utilizados sobre as amostras de DNA das fezes. Os resultados obtidos pelos testes diagnósticos foram analisados pelo software Stata 14, para obtenção dos dados epidemiológicos e de concordância (kappa). Os resultados revelaram melhores variações de absorbância (entre 1,87 e 1,9) para as DNAs extraídas por meio do kit comercial, sendo estes selecionados para aplicação no sistema Sm1-7qPCR. A otimização do sistema de qPCR obteve Ct de corte 35,32 para 1 fg/µL. A sensibilidade epidemiológica foi de 73,3% para Kato-Katz; 66,7% para Hoffman; e o mesmo valor de 86,7% para Nested-PCR e qPCR. A concordância comparada à infecção por cercária foi ótima para Sm1-7qPCR (𝛫 = 0,867; p < 0,001). Diante disso, as extrações obtidas por meio de kit comercial devem ser priorizadas para garantir o bom desempenho das técnicas moleculares aplicadas ao diagnóstico. Ademais, a Sm1-7qPCR se revelou como uma ferramenta útil para aplicação no diagnóstico da esquistossomose, uma vez que detectou a presença de S. mansoni em amostras biológicas em 13 dos 15 camundongos infectados.