Purificação e caracterização parcial de uma lectina presente no soro do peixe tilápia (Oreochromis niloticus): atividade imunomodulatória em esplenócitos de camundongos

Abstract

As lectinas são um grupo de proteínas que se ligam especificamente a carboidratos e aglutina diferentes células através da ligação a glicoconjugados da superfície celular. A propriedade de ligação a carboidratos determina a classe da lectina que é promovida pelo domínio de reconhecimento de carboidratos (CRD). O estudo com lectinas de peixes propriedade, funções e eventos biológicos foi apresentado em forma de artigo de revisão. A lectina do soro de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), OniL, foi parcialmente purificada e caracterizada. A pré-purificação foi realizada por precipitação com sulfato de amônio (fração 20-40%), F2, seguida de diálise, atividade hemaglutinante e inibição da atividade hemaglutinante. A fração foi cromatografada em matriz de afinidade (Con A-Sepharose 4B) e eluída com metil-α-D-mannopyranosideo (200 mM) em TBS seguida de diálise para avaliar suas características bioquímicas como: especificidade a caboidratos, teste de temperatura e íons, SDS-PAGE e PAGE. Nos ensaios imunológicos, in vitro, foram analisados índices de citotoxidade e proliferação, produção de citocinas, viabilidade celular e tipo de resposta imune em culturas de esplenócitos de camundongos BALB/c. No ensaio de citotoxidade, seis concentrações (100, 50, 25, 10, 5 e 1 μg/mL) de OniL foram analisadas por 24 h; saponina foi empregada como um controle positivo; para avaliar a atividade proliferativa, células foram tratadas por 72 h com OniL (2,5, 5 e 10 μg/mL) ou Con A (2,5 μg/mL) comparando com o controle; a citotoxidade e proliferação dos compostos foi determinada comparando o percentual de incorporação da [3H]-timidina como indicador de viabilidade celular usando radiação beta counter. A produção de citocinas (IL-2, IL-6, IL-10 e IFN-γ) foi determinada por ELISA; sobrenadantes de cultura não tratadas foram considerados controles; as culturas foram estimuladas durante 24, 48, 72 h e 6 dias com concentrações de 10 μg/mL de OniL e 2,5 μg/mL de Con A, este último tratamento considerado o controle positivo. A morte celular, analisada por citometria de fluxo, foi verificada com marcadores Anexina V-FITC e Iodeto de Propídeo. Os esplenócitos foram estimulados por 24 e 48 h com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL); células marcadas com Anexina-FITC (negativa) e Iodeto de propídeo (positivo) foram consideradas necróticas; Anexina-FITC (positiva) e Iodeto de Propídeo (negativa), apoptóticas. O método colorimétrico de Griess avaliou a concentração de nitritos dos sobrenadantes de culturas tratadas com OniL (10 μg/mL) e Con A (2,5 μg/mL) nos tempos de 24, 48, 72 h e 6 dias de incubação. F2 e OniL apresentou atividade hemaglutinante específica de 330,3 e 94,7, respectivamente. A lectina purificada apresentou um rendimento de 31,1%; OniL, aglutina eritrócitos de coelho (título, 64-1) e eritrócitos humanos A, B, AB e O (título, 8-1, 64-1, 4-1 e 32-1, respectivamente); a atividade hemaglutinate foi detectada numa faixa de pH entre 7,0 e 11,0 e foi completamente preservada após o aquecimento de 10 min a 25, 30, 40, 50 e 60 °C, porém a atividade foi completamente abolidas após 70 °C. A adição de um agente quelante de Ca2+, EDTA, diminuiu a atividade revelando que OniL é uma lectina cálcio-dependente. O peso molecular foi de 17 kDa na SDS-PAGE em condições não redutoras; e 11 e 6,6 kDa na presença de uma agente redutor a proteína apresentou duas subnidades ligadas por pontes disulfeto; OniL apresentou-se, através de PAGE, como uma proteína ácida com banda única de polipeptídeo. Os ensaios imunológicos revelaram que OniL não é citotóxica para esplenócitos de camundongos e induziu alta produção de citocinas em relação ao controle: IFN-γ (24 h), IL-2 e IL-6 em todos os tempos analisados. Porém, a produção de IL-10 e concentrações de nitritos foram baixas quando comparadas com o controle; OniL apresentou atividade proliferativa em relação ao controle para todas as concentrações e não induz morte celular significativa nos tempos analisados. A lectina purificada do soro de tilápia (Oreochromis niloticus) é manose-específica, não apresenta citotoxidade para esplenócitos, com atividade imunomoduladora induzindo produção de citocinas para diferenciação e proliferação de células preferencialmente Th1 CD4+, assim, esta proteína pode ser utilizada como um potente agente mitogênico em mamíferos.