Desenvolvimento de uma construção vacinal baseada no gene E5 de BPV usando códon usage a ser aplicada em imunização genética

Abstract

Os papilomavírus constituem um grupo de pequenos vírus de DNA de dupla fita caracterizados por induzirem a formação de lesões que são em geral benignas, podendo regredir naturalmente ou se transformar em tumores malignos, gerando importantes perdas econômicas aos criadores. Os BPVs tipo 1 e 2 são carcinogênicos e estão relacionados com o câncer da bexiga urinária e o tumor sarcóide em eqüino. Como existem muitos animais já infectados e afetados pela doença, uma estratégia vacinal terapêutica torna-se necessária e muito aguardada pelos criadores. A imunização genética é uma estratégia bastante eficaz na indução de imunidades humoral e celular em grande número de modelos animais. O foco deste trabalho foi realizar a construção e avaliação funcional in vitro do vetor vacinal pCIE5sintB1/B2, usando o gene E5 otimizado para expressão em célula de mamífero. As sequências do gene E5 dos BPVs 1 e 2 foram obtidas do GeneBank e analisadas quanto a suas diferenças e ao uso preferencial de códons, sendo então construída uma sequência otimizada a qual foi sintetizada (E5sintB1/2), contendo um epitopo AU1 na região N-terminal. O gene E5sint foi então clonado no vetor de expressão pCI-neo usando sítios de restrição inseridos no gene sintético. A construção pCIE5sintB1/2 foi seqüenciada para confirmação. Para análise da funcionalidade o vetor pCIE5sintB1/2 foi utilizado para transfectar em células 293, usando o Kit TransFast. Após 48 horas de cultivo, as células foram coletadas e os extratos celulares processados para preparação do extrato protéico celular e de RNA total. A expressão gênica foi avaliada por meio de RT-PCR, SDS-PAGE, Dot Blot e Western Blot (usando anticorpo contra o epítopo AU1). Os resultados obtidos mostraram que apenas as células transfectadas com a construção pCIE5sintB1/B2 apresentaram transcrição do gene E5 e conseqüente produção da proteína. Estes resultados confirmam a expressão do antígeno vacinal em células de mamífero