Construção de genes sintéticos codificando proteínas do vírus da febre amarela: análise de expressão e tráfego celular de polipeptídeos selvagens e fusionados a proteína de associação à membrana lisossomal (LAMP)

Abstract

A vacinação com o vírus atenuado 17D/17DD é o principal método de prevenção da Febre Amarela. Apesar do sucesso desta vacina em todo o mundo, reações adversas, aumento da severidade dos sintomas e até casos fatais têm sido reportados, o que estimula o desenvolvimento de uma vacina de DNA codificando seqüências específicas do vírus da Febre Amarela (VFA). Entretanto antígenos codificados por vacinas de DNA são expressos intracelularmente e preferencialmente apresentados ao sistema imune através de moléculas do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe I (MHCI). O aumento da eficiência destas vacinas é possível através da fusão de seus antígenos com a Proteína de Associação à Membrana Lisossomal humana (hLAMP-1), direcionando-os para o compartimento do Complexo Maior de Histocompatibilidade de classe II (MHCII). A via do MHCII é responsável pela ativação de linfócitos T CD4+, importantes para sustentar a resposta celular de linfócitos T CD8+ e para o desenvolvimento de memória, mudança de classe de anticorpos e expansão clonal de linfócitos B antígeno-específicos. As quimeras antígeno/LAMP apresentam uma maior indução da resposta imune quando comparadas aos antígenos nãofusionados à LAMP. Neste trabalho, apresentamos a análise da expressão e localização intracelular das proteínas não-estruturais NS1 e NS3 do VFA, nas suas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. Para tanto, as seqüências de DNA das proteínas NS1 e NS3 foram selecionadas no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e otimizadas através do algoritmo genético do programa LETO 1.0 (Entelechon®), de acordo com parâmetros como codon usage, estrutura secundária do mRNA, distribuição do conteúdo GC, motivos repetitivos de DNA, sítios crípticos de splicing, dentre outros, com o intuito de aumentar a expressão antigênica. As seqüências de DNA otimizadas foram enviadas para síntese comercial (Geneart®) e clonadas em vetores de expressão eucarióticos, nas formas fusionadas e não-fusionadas à LAMP. As construções vacinais obtidas foram enão utilizadas na transfecção de células eucarióticas cujos extratos foram analisados quanto à expressão protéica através de ensaios de Western-blot e imunofluorescência, utilizando anticorpos policlonais específicos produzidos através da imunização de coelhos com proteínas NS1 e NS3 recombinantes. Nestes ensaios, todas as construções vacinais apresentaram expressão eficiente e distribuição intracelular adequada. Enquanto as proteínas nativas apresentaram a distribuição reticular característica, os antígenos fusionados à LAMP apresentaram uma distribuição lisossomal típica do LAMP endógeno. As respostas imunes geradas contra as construções vacinais de NS1 foram avaliadas em camundongos BALB/c. Ambas as construções, fusionada e não-fusionada à LAMP, foram capazes de induzir uma forte resposta celular contra os mesmos epítopos induzidos pela vacina convencional 17DD. A resposta gerada pela construção fusionada a LAMP, entretanto, apresentou a melhor performance. Os resultados obtidos neste trabalho serão integrados a dados previamente obtidos em nosso laboratório em estudos com proteínas estruturais para o desenvolvimento de vacinas de DNA capazes de neutralizar infecções pelo VFA