Desenvolvimento de um sistema de genética reversa para o vírus dengue tipo 3, isolado em Recife

Abstract

Os vírus dengue (DENV) são responsáveis por um amplo espectro de manifestações clínicas em diversas partes do mundo. Muitos mecanismos moleculares da biologia do DENV, incluindo replicação do genoma e patogênese viral, ainda não foram totalmente compreendidos. Novos avanços na elucidação destes mecanismos vêm sendo facilitados pelo desenvolvimento dos sistemas de genética reversa nas últimas décadas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um sistema de genética reversa para o vírus dengue tipo 3 (DENV3). Usando um sistema de dois plasmídeos, o genoma do DENV3 foi dividido em duas partes por PCR e os fragmentos gerados foram clonados em separado num vetor plasmidial. Um sítio de restrição foi inserido em ambas as construções, permitindo a posterior recuperação do genoma completo por ligação in vitro. Todos os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e propagados nela para prevenir qualquer instabilidade dos insertos em E. coli. A identidade das construções foi confirmada por sequenciamento, no qual foram identificadas mutações no genoma clonado. Para a recuperação do clone infeccioso in vitro, as duas partes dos genomas foram amplificadas por PCR, digeridas e unidas por ligação in vitro. Dois clones infecciosos foram recuperados e a transcrição in vitro, do produto das ligações, produziram RNAs virais genômicos. Células BHK-21, transfectadas por eletroporação com os RNAs sintetizados, foram avaliadas por ensaio de imunofluorescência, mostrando que estes RNAs são infecciosos. Após sucessivas passagens em cultivo celular, os DENV3 recuperados foram caracterizados in vitro. RT-PCR, a partir de RNA viral, e a análise de fragmentos de restrição confirmaram que ambos os vírus recuperados foram derivados do nosso sistema de dois plasmídeos. No ensaio de placa, os clones apresentaram fenótipos distintos. Após coloração convencional, enquanto o clone ICDENV3 #L43 apresentou placas com morfologia similar ao DENV3 selvagem, o clone ICDENV3 #L42 foi incapaz de formar placas. A análise de sequenciamento, a partir dos produtos de RT-PCR, identificou mutações específicas em cada um dos clones, as quais podem facilitar o crescimento dos vírus recuperados em cultivo celular. Este sistema é uma poderosa ferramenta que nos ajudará a elucidar aspectos moleculares da biologia do DENV, bem como a entender a relação entre mutações específicas e a patogênese do DENV