Avaliação de metodologias in house para extração de DNA genômico de Mycobacterium tuberculosis

Abstract

A tuberculose permanece como um dos principais desafios de saúde pública mundial, e o diagnóstico molecular tem papel essencial no enfrentamento da doença, especialmente pela rapidez e sensibilidade das técnicas de amplificação de ácidos nucleicos. A eficiência dessas metodologias depende diretamente da qualidade do DNA extraído, o que torna fundamental a escolha de protocolos eficazes, reprodutíveis e economicamente viáveis. Este estudo avaliou três metodologias in house de extração de DNA de Mycobacterium tuberculosis - Mini Salting Out (MSO), Fenol-Clorofórmio (FC) e Brometo de Cetiltrimetilamônio (CTAB) - aplicadas à cepa H37Ra e a amostras biológicas contaminadas experimentalmente (sangue, escarro e urina). As etapas compreenderam cultivo da cepa, preparação das amostras biológicas, inativação térmica e enzimática, execução dos três protocolos, quantificação por espectrofotometria, avaliação das razões 260/280 e 260/230, eletroforese e qPCR direcionada ao IS6110, além de análise de custo por amostra. Os resultados mostraram que, em cepas H37Ra, as médias de concentração foram 202,5 ng/µL (MSO), 47,8 ng/µL (FC) e 85,6 ng/µL (CTAB), com diferenças significativas para MSO vs. FC (p=0,0003) e CTAB vs. FC (p=0,0348). No sangue total, as médias foram 202,9 ng/µL (MSO), 147,9 ng/µL (FC) e 218,1 ng/µL (CTAB), com MSO superior a FC (p=0,0228) e CTAB também maior que FC (p=0,003). No escarro, observaram-se médias de 493,4 ng/µL (MSO), 397,7 ng/µL (FC) e 1665,9 ng/µL (CTAB), sendo CTAB significativamente superior aos demais (p=0,0003 vs. MSO; p=0,0008 vs. FC). Na urina, CTAB novamente apresentou maior concentração (30,95 ng/µL), seguido de FC (16,9 ng/µL) e MSO (14,65 ng/µL), com diferenças significativas entre CTAB e os demais métodos (p=0,0001 para ambas as comparações). Apesar das concentrações elevadas observadas em CTAB, as razões de pureza e a eletroforese mostraram inconsistências importantes, com bandas frágeis ou ausentes, sugerindo possível superestimação por contaminantes residuais. Já MSO apresentou razões mais próximas dos valores ideais em H37Ra e sangue, enquanto FC exibiu menor pureza global. Nos ensaios de qPCR, houve amplificação em todas as amostras extraídas por MSO e nas cepas e no escarro por FC; entretanto, FC falhou parcialmente em sangue total, e CTAB não apresentou amplificação em urina e sangue total, confirmando a presença de inibidores da qPCR. A análise de custo-benefício revelou MSO como o método mais econômico (R$ 1,65 por amostra), seguido de FC (R$ 3,56 por amostra) e CTAB (R$ 4,83 por amostra). Em síntese, MSO mostrou melhor equilíbrio entre rendimento, pureza, integridade do DNA, amplificação por qPCR e custo, sendo o protocolo mais adequado para aplicações moleculares de rotina laboratorial.