Avaliação da atividade antimicrobiana e toxicidade do ácido úsnico encapsulado em lipossomas revestidos com fucana

Abstract

A Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), um dos agentes etiológicos da pneumonia, vem apresentando resistência aos fármacos beta-lactâmicos e carbapenêmicos, além de ser uma bactéria produtora de biofilme. Com isso, ativos extraídos de líquens e que apresentam atividade antibacteriana, como o ácido úsnico (AU), por exemplo, tem sido proposto como fármaco para o tratamento de cepas da K. pneumoniae. Apesar de sua atividade, o AU apresenta baixa solubilidade em água e elevada toxicidade, tornando-o candidato para encapsulamento em lipossomas (Lipo). Levando em consideração que a K. pneumoniae reside dentro de macrófagos alveolares e que estas células expressam proteínas de membrana quando infectad as, a utilização de moléculas de revestimento, como a fucana (Fuc), polissacarídeo sulfatado, por exemplo, pode direcionar os nanossistemas para o sítio de infecção da K. pneumoniae, além de permitir modular a cascata de coagulação sanguínea. Além da eficácia terapêutica, a avaliação da toxicidade de nanossistemas é de suma importância, o que pode ser realizada através da utilização de modelos in vivo como o Caenorharbditis elegans (C. elegans), nematoide de vida

livre. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade antibacteriana de AU- Lipo/Fuc contra cepas resistentes da K. pneumoniae e avaliar a atividade anticoagulante de Fuc

e Lipo/Fuc. Por fim, foi avaliada a toxicidade de AU-Lipo/Fuc utilizando o modelo C. elegans. AU-Lipo/Fuc foi obtido pelo método de hidratação do filme lipídico e caracterizado através de tamanho médio de vesículas (TP), índice de polidispersão (PDI), potencial zeta (ζ) e eficiência de encapsulação (EE%). Para obtenção de lipossomas fluorescentes (Lipo-Rod), foi adicionada Rodamina-B à fase orgânica (12,5 μg/mL). A atividade antibacteriana foi avaliada através da determinação da concentração inibitória mínima (CIM) e da concentração bactericida mínima (CBM) contra cepas resistentes da K. pneumoniae. Logo em seguida, a inibição da produção de biofilme e erradicação do biofilme foram quantificadas pelo método do cristal violeta e os resultados expressos como concentração inibitória mínima da inibição de biofilme (CIMB) e concentração de erradicação mínima de biofilme (CEMB), respectivamente. A atividade anticoagulante de Lipo e Lipo/Fuc foi determinada através da via extrínseca (Tempo de Protrombina - TP) e via intrínseca (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada - TTPA). A fim de avaliar a ingestão de Lipo pelo C. elegans, vermes no estágio L4 foram expostos a Lipo-Rod e analisados por microscopia de fluorescência. Para avaliação da toxicidade, vermes L4 foram expostos a diferentes concentrações de AU-Lipo e AU-Lipo/Fuc e concentrações equivalentes de Lipo e Lipo/Fuc, durante 24 h e em seguida determinados os parâmetros CL50, batimento

faríngeo, ovo-produção e ovo-posição dos vermes. Lipo, Lipo-Rod e AU-Lipo apresentaram diâmetro em torno de 100 nm. Por sua vez, Lipo/Fuc e AU-Lipo/Fuc apresentaram aumento no diâmetro de vesícula (137,3 ± 2.1; 1.048,6 ± 206,5), evidenciando a presença da Fuc na superfície dos nanossistemas, respectivamente. Todas as formulações apresentaram índice de polidispersão abaixo de 1 e aquelas contendo AU apresentaram EE% > 97%. AU-Lipo/Fuc apresentou atividade antibacteriana (CIM 250 μg/mL; CBM 1.000 μg/mL), bem como maior atividade de inibição e erradicação do biofilme, respectivamente (CIMB 0,48 μg/mL; CEMB 0,48 μg/mL). Não houve prolongamento no TP para Fuc e Lipo/Fuc, porém houve prolongamento do TTPA nas concentrações de 62,5 e 125 μg/mL, respectivamente. Após 24h de exposição, os lipossomas estiveram distribuídos através do tubo intestinal dos vermes, evidenciando a efetiva ingestão de Lipo-Rod, e houve 100% de sobrevivência, sem alteração do batimento faríngeo, ovo-produção e ovo-posição. Desta forma, os resultados revelam a atividade de erradicação de biofilme frente cepas de K. pneumoniae resistentes e ausência de toxicidade de AU-Lipo/Fuc. Ademais, a atividade anticoagulante da Fuc foi verificada, o que permite a continuidade de ensaios de eficácia in vivo de AU-Lipo/Fuc em modelos de pneumonia.