Estabelecimento do método de biobalística em milho visando aumento na eficiência da transformação genética

Abstract

O milho (Zea mays L) é um cereal de extrema relevância para a agricultura familiar e o agronegócio brasileiro. A transformação genética desta cultura tem sido amplamente estudada ao longo dos anos, visando a obtenção de características superiores e resistência a doenças. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um protocolo eficiente para a transformação genética do milho via biobalística, utilizando genes repórteres (GUS e RUBY) em embriões imaturos do milho (linhagem B104) para verificação da expressão gênica. Foram realizados desenho de primers para posterior PCR de colônias e confirmação de plasmídeo. Posteriormente, foram conduzidas as etapas de coleta das espigas de milho (cultivo desenvolvido em casa de vegetação através da polinização manual), desinfestação e isolamento de embriões, e, posteriormente, as etapas de extração e purificação do DNA plasmidial – miniprep. Em seguida, dois experimentos foram realizados, no primeiro experimento, os parâmetros físicos (distância de posicionamento dos embriões e quantidade de membranas de ruptura) foram analisados mediante seis tratamentos, nomeados de A a E, onde o melhor entre eles foi selecionado pela expressão transiente do gene repórter RUBY (quantidade de transformantes). No segundo experimento, foi verificado se dois bombardeamentos em uma única placa aumentaria a expressão temporária do gene repórter GUS. A melhor eficiência para RUBY foi obtida com o tratamento C (três membranas de ruptura e uma distância de 11,5 cm entre a membrana carreadora e o explante), resultando em três embriões imaturos em iniciação de calos expressando o referido gene repórter. Para GUS, dois disparos por placa levaram a uma maior taxa de expressão. A experiência adquirida neste estudo será aplicada no laboratório para futura implementação da metodologia. Os resultados reforçam a importância da otimização dos parâmetros para a regeneração de embriões e destacam GUS e RUBY como genes repórteres eficazes para triagem de explantes transformados. O conhecimento obtido poderá ser utilizado para testar outros genes repórteres e aprimorar a expressão estável, aumentando as chances de sucesso na obtenção de plantas transgênicas de milho.