Desenvolvimento e aplicação biotecnológica de replicons repórteres para triagem de drogas antivirais contra o vírus da febre amarela

Abstract

A re-emergência da febre amarela e sua significância como um problema de saúde pública tem gerado um interesse para o desenvolvimento de novas ferramentas vacinais e agentes antivirais contra este vírus. Drogas antivirais, específicas para o vírus da febre amarela, não estão disponíveis para a população e cerca de 200.000 casos são estimados por ano no mundo. Métodos tradicionais para triagem de antivirais são laboriosos, demorados e dificultosos para serem utilizados em testes em larga escala. O objetivo deste trabalho foi avaliar as propriedades antivirais de diversos substratos naturais da biblioteca da Fiocruz-MG, usando uma linhagem celular estável expressando um replicon bicistrônico do vírus da febre amarela. O replicon nomeado rep-FA17D-LucNeoIres foi construído em nosso laboratório, através da deleção da proteínas estruturais virais e inserção dos genes do repórter Luciferase firefly, neomicina fosfotransferase, e um elemento Ires (Internal Ribosome Entry Site) para a tradução das proteínas não-estruturais virais. Assim, a replicação do genoma do replicon pode ser mensurada pela expressão do gene repórter Luciferase. Neste estudo nós analisamos cerca de 2000 extratos naturais brasileiros (através de um ensaio em larga escala) utilizando-se a linhagem celular BHK-21-rep-FA17D-LucNeoIres, a qual expressa constitutivamente o replicon construído. A eficiência deste sistema foi comprovada inicialmente através de uma caracterização criteriosa, com ensaios de replicação celular e utilização do antiviral interferon alfa, os quais comprovaram que o método desenvolvido é sensível, rápido e muito eficiente para triagem de drogas antivirais em larga escala. Entre os extratos naturais estudados, trinta e cinco extratos apresentaram uma inibição de 50% ou mais na expressão do gene repórter luciferase, sendo que nenhum destes extratos apresentou características citotóxicas. Estudos adicionais estão sendo realizados para a caracterização antiviral destes 35 extratos identificados. No presente estudo foi desenvolvida uma técnica inovadora de triagem antiviral e os resultados obtidos com os extratos naturais podem ser de grande impacto para a identificação e desenvolvimento de drogas antivirais contra flaviviroses