Bioconjugados de pontos quânticos e anticorpos aplicados em fluoroimunoensaios para detecção de biomoléculas da Zika

Abstract

A infecção pelo Zika vírus (ZIKV) ainda é uma realidade no Brasil e a ausência de uma vacina disponível para prevenir a Zika torna essencial o aprimoramento de métodos de diagnóstico mais sensíveis e menos laboriosos para o enfrentamento desta doença. Assim, os fluoroimunoensaios são uma abordagem promissora. Os pontos quânticos (PQs) têm se destacado no desenvolvimento de tecnologias baseadas em imunofluorescência, visto que, apresentam excelentes propriedades ópticas, como alta resistência à fotodegradação, emissão de luz sintonizável com o tamanho e superfície quimicamente ativa para bioconjugação. Assim, o presente estudo obteve bioconjugados de PQs e anticorpos (anti-PE ZIKV e anti-IgM humano) empregados em fluoroimunoensaios diretos para detecção da proteína E do Zika (PE-ZIKV) e indiretos para anticorpos IgM, utilizados como modelos. Para tanto, foram sintetizadas duas suspensões de PQs de CdTe carboxilados. Os PQs foram caracterizados opticamente, conjugados covalentemente aos anticorpos, avaliados pelo ensaio fluorescente em microplaca (EFM) e aplicados para fluoroimunodetecção. Com isso, para o ensaio direto, os poços foram previamente sensibilizados com diferentes concentrações dos anticorpos de captura [(anti-PE-ZIKV (2 e 1 μg/mL por poço)], posteriormente, os poços foram lavados com solução salina, seguido do bloqueio com albumina sérica bovina (BSA a 5%), e com incubações overnight a 4 °C. Em seguida, a PE-ZIKV (1 e 0,5 μg por poço) foi adicionada aos poços para detecção. Por fim, o conjugado de (PQs-anti-PE ZIKV) previamente bloqueado com TRIS base foi adicionado, e incubado por 2 h em banho maria à 37°C. Já para o ensaio indireto, os poços foram sensibilizados com 2 e 1 μg por poço de IgM, seguido também de lavagens e bloqueio com BSA. Finalmente, o conjugado de (PQs-anti-IgM) bloqueado foi adicionado aos poços para a detecção. Nesse caso a incubação ocorreu inicialmente por 2 h à 4 ºC e posteriormente foi reduzida para um tempo de 30 min. Como resultados, os PQs apresentaram diâmetro de ca 3 nm. Já o EFM indicou eficiência das bioconjugações, com fluorescência relativa (FR%) de 4.847% e 5.477% para os conjugados de anti-PE ZIKV e anti-IgM respectivamente. O conjugado (PQs-anti-PE ZIKV) mostrou-se eficiente na detecção sensível de PE-ZIKV (até 0,5 μg por poço) mesmo quando a placa foi sensibilizada com a menor concentração do anticorpo de captura. Enquanto que o conjugado de (PQs-anti-IgM) também detectou pelo menos 1 μg por poço de IgM humana, e com menor tempo de detecção. Ademais, ambos os conjugados se mantiveram fluorescentes e ativos por pelo menos 12 meses de armazenamento, indicando ter estabilidade. Portanto, os bioconjugados de PQs-anti-PE ZIKV e PQs-anti-IgM mostraram-se promissores para aplicação em fluoroimunoensaios diretos na detecção de ZIKV e indiretos na identificação de moléculas modelo, respectivamente, com potencial para serem estendidos para outras biomoléculas.