Construção de vetor de expressão para dupla ancoragem de proteínas recombinantes na superfície de Pichia pastoris

Abstract

O SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 - Coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2), agente causador da doença do coronavírus 2019 (COVID-9), ainda é considerado uma ameaça, mesmo após o fim da pandemia, principalmente pelas diferentes variantes que continuam surgindo. Por isso se destaca a importância da vacinação contra o vírus. Dentre as possibilidades de tecnologias vacinais estão as vacinas de subunidade carreadas por leveduras, uma abordagem promissora para estimular respostas imunológicas eficazes contra os antígenos vacinais. O presente trabalho propõe a construção de vetores de expressão que permitam a exposição de proteínas derivadas do SARS-CoV-2 na superfície da levedura Pichia pastoris. Para isso, os genes SCoV-SintΔ (gene sintético multiepítopos) e RBDwt do SARS-CoV-2 foram amplificados para posterior clonagem no vetor de expressão pPGKPVY_Agα a ser construído. O cassete de expressão em construção para o vetor inclui o gene promotor PGK1, o peptídeo sinal MF-α, sequência IRES PVY (que permitirá a dupla ancoragem) e, posteriormente incluirá os genes de interesse fusionados à uma tag de 6xHIS e a proteína âncora α-aglutinina. No vetor de expressão pPGK foi adicionada a sequência IRES PVY para recrutamento de ribossomos e garantia da continuidade da síntese de proteína. A α-aglutinina I, II, que contém a mesma sequência, porém com sítios diferentes para serem inseridas em diferentes posições no cassete, permitirão a exposição das proteínas recombinantes na superfície da levedura, e o MF-α (fator alfa), que irá secretar as proteínas produzidas, também foram amplificados e preparados para inserção no cassete de expressão. Após a construção do vetor e inserção dos genes, espera-se a obtenção de linhagens de P. pastoris recombinantes a partir de transformação, para então avaliar a expressão das proteínas virais, a dupla ancoragem e sua validação a partir de análises imunológicas in vitro e in vivo. O carreamento de mais de uma proteína recombinante na superfície da levedura abre novas perspectivas na produção de vacinas contra uma ampla gama de agentes infecciosos. Com a construção deste vetor, espera-se contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de vacinação profilática contra o SARS-CoV-2, além de demonstrar a utilização de leveduras como plataforma vacinal.