Mapeamento e análise de interações envolvidas na formação do complexo EIF4E6/ EIF4G5 de Trypanosoma brucei

Abstract

Os tripanosomatídeos são protozoários flagelados responsáveis por doenças negligenciadas e se caracterizam por apresentar peculiaridades biológicas no controle da sua expressão gênica, regulada por eventos predominantemente pós- transcricionais e que atuam durante a tradução dos mRNAs. Em eucariotos, o reconhecimento do cap do mRNA pelo complexo eIF4F, formado pelas subunidades eIF4E e eIF4G, é um ponto chave no processo de regulação da tradução. Múltiplos homólogos de eIF4E e eIF4G foram identificados em tripanosomatídeos, formando diferentes complexos do tipo eIF4F. Esse trabalho buscou estudar e caracterizar em T. brucei o complexo formado pelas proteínas EIF4E6/EIFG5 e sua parceira EIFG5- IP. Primeiro, foi investigada a interação EIF4E6/EIF4G5, por ensaios in vitro de interação de proteína-proteína e pela resolução, por meio de cristalografia, da estrutura do EIF4E6 associado a um peptídeo derivado do EIF4G5 N-terminal (79- 116). Essa estrutura, a mais divergente de interação eIF4E-eIF4G já caracterizada, permitiu definir elementos claros que garantem sua especificidade. Outras interações envolvendo os EIF4E6/EIF4G5/EIF4G5-IP, em células procíclicas do T. brucei, foram então mapeadas, mostrando sua associação com proteínas da zona de fixação do flagelo e de citoesqueleto além de diferentes proteínas de ligação a RNA. Para mapear elementos envolvidos em interações relevantes, foram realizadas truncagens na EIF4G5-IP e mutagênese de motivos conservados no EIF4G5, seguidos de análises de interação proteína-proteína in vitro e in vivo. Foi possível assim mapear regiões envolvidas na interação EIF4G5/EIF4G5-IP, bem como avaliar o papel de regiões específicas nas interações com diferentes parceiros. Por fim, confirmamos a atuação desse complexo no processo de tradução apenas na fase sanguínea do parasita com presença de diversos fatores de iniciação da tradução e proteínas ribossomais. Sendo assim, nossos experimentos ajudam a entender de forma impactante o papel deste complexo em T. brucei e espécies relacionadas.