Análise genômica e proteômica de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa resistentes aos carbapenêmicos produtores de biofilme

Abstract

A ocorrência de Pseudomonas aeruginosa resistente aos carbapenêmicos (CRPA) tornou-se um sério problema de saúde pública em todo o mundo, pois reduz as opções terapêuticas contra esse microrganismo, além disso, a produção de biofilme por estes microrganismos agrava ainda mais este problema. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a ocorrência de genes de β-lactamases e do quorum sensing (QS) em isolados de CRPA, analisar a produção de biofilme, avaliar a resposta deles frente à monoterapia com meropenem (MPM) ou polimixina B (POL B) e sua associação com azitromicina (AZT) usando pontos quânticos (QDs) e análise proteômica, além da analisar o genoma destes isolados. Seis isolados de CRPA foram analisados neste estudo. A busca dos genes das β- lactamases (blaKPC, blaSPM-1, blaIMP e blaVIM) e QS (lasI, lasR, rhlI e rhlR) foi realizada por meio de PCRs específicas e pesquisa da produção de biofilme por realizada por técnica quantitativa. Um isolado de CRPA, contendo o gene blaKPC e produtor de biofilme, foi selecionado para avaliar sua resposta à terapia usando QDs conjugados a MPM como uma sonda e o MS pela técnica de dessorção a laser assistida por matriz / tempo de voo de ionização (MALDI-TOF) para avaliar a expressão de proteínas. O único gene de β-lactamase detectado foi o blaKPC em 66,7% dos isolados. Todos os isolados foram produtores de biofilme e portadores dos genes do QS. Os conjugados QDs-MPM desencadearam a formação de biofilme pelo isolado e a associação com AZT inibiu esse efeito. A análise proteômica mostrou que os tratamentos com MPM ou POL B suprimiram a expressão da proteína transglicosilase, enquanto a terapia combinada com AZT resultou na expressão da proteína RpoN. O sequenciamento genômico dos isolados foi realizado usando a plataforma Illumina MiSeq. A montagem foi realizada usando o pipeline A5-miseq, e a predição do gene foi determinada usando os pipelines RAST e Prokka. A análise de MLST foi conduzida usando a ferramenta do site http://www.genomicepidemiology.org/. A análise genômica mostrou a presença de um genoma maior no isolado JX03, apresentando 6.136.978 bp, enquanto o isolado JX05 teve um genoma com 5.607.393 bp. O resistoma revelou que os isolados abrigavam o gene blaKPC em um pequeno contig associado com ISKpn6, e ambos tinham genes relacionados à bombas de efluxo, mutações do gene gyrA, genes de porina e enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (AMEs). A análise de MLST revelou que o isolado JX03 pertence ao tipo clonal ST244, enquanto o JX05 pertence ao ST277, clone epidêmico brasileiro. Além disso, descrevemos neste estudo o primeiro relato de um isolado pertencente ao clone ST277 portador do gene blaKPC sem apresentar o gene blaSPM-1. Assim, este estudo mostra que o uso da fluorescência combinada com a análise proteômica foi promissor para entender como uma cepa de CRPA reage ao tratamento antimicrobiano e também demonstra a disseminação do gene blaKPC no país como um dos principais mecanismos de resistência aos carbapenêmicos.