Investigação do potencial antifúngico de lectina de sementes de Moringa oleífera (WSMoL) contra espécies de Candida e Cryptococcus

Abstract

Moringa oleifera Lamarck (Moringaceae) é uma planta com sementes contendo lectinas (proteínas que se ligam a carboidratos), dentre elas a lectina solúvel em água de sementes de M. oleifera (WSMoL). O objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antifúngica e antibiofilme de WSMoL contra leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus, bem como efeitos subcelulares que possam estar relacionados com essa lectina. WSMoL foi isolada por cromatografia em coluna de quitina seguindo procedimento previamente estabelecido. A atividade antifúngica foi avaliada através da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) pelo ensaio de microdiluição e a concentração mínima fungicida (CMF) que foi obtida apartir da CMI, sendo um inoculado em placa de petri contendo Sabouraud. Foram estabelecidas as curvas de crescimento na ausência e presença da lectina em concentrações que variaram entre 4 × MIC, 2 × MIC, MIC, 1⁄2MIC, ou 1⁄4MIC. Através de citometria de fluxo, utilizando sondas fluorescentes apropriadas, foram investigadas a ocorrência de morte celular por apoptose ou necrose, alterações no potencial da membrana mitocondrial (∆Ψm) e influência na integridade lisossomal. Adicionalmente, foi avaliada a atividade antibiofilme de WSMoL sobre o isolado Cryptococcus neoformans B3501, apenas nessa cepa por ter sido capaz de formar biofilme. WSMoL apresentou efeito inibitório no crescimento de todas as espécies de Candida com CMI de 20 μg/mL. Atividade fungicida foi detectada, sendo os menores valores de CMF para C. glabrata e C. krusei (20 e 40 μg/mL, respectivamente). O ensaio de cinética de crescimento revelou que o efeito fungistático se inicia entre nona e a décima nona hora de incubação, dependendo da espécie de Candida. A WSMoL, na CMI, teve o número de células apoptóticas e necróticas aumentado após 24 horas de incubação em C. albicans C. glabrata e C. krusei, Já para C. parapsilosis, houve aumento somente no número de células apoptóticas. Após 12 h de incubação, WSMoL induziu hiperpolarização da membrana mitocondrial das células de Candida, seguida por redução do ∆Ψm com 24 horas. Danos à integridade dos lisossomos não foram detectados nas células de Candida. Com relação às leveduras do gênero Cryptococcus, WSMoL apresentou efeito fungistático (CMI: 6,25 μg/mL) sobre as linhagens B3501 e H99 de C. neoformans e R265 de C. gattii, porém não foi detectada ação fungicida. Foi observado que na CMI a cepa H99 apresentou um maior número de células necróticas (9,9% das células em comparação com somente 3,8% no controle negativo). Na mesma concentração não se observou necrose para B3501 e R265. As curvas de crescimento indicaram efeito inibitório sobre H99 se iniciando por volta de 12 horas de incubação. Para B3501 e R265 WSMoL começou a apresentar efeito inibitório a partir de 16 horas e 20 horas, respectivamente. O tratamento com a lectina resultou em danos na integridade dos lisossomos de células de B3501 e R265, bem como despolarização mitocondrial em B3501. WSMoL, em concentrações entre 25 e 400 μg/mL, inibiu a formação de biofilme por C. neoformans B3501, único isolado que se mostrou capaz de produzir biofilme. Em conclusão, WSMoL apresenta potencial antifúngico contra leveduras dos gêneros Candida e Cryptococcus por induzir eventos que comprometem a homeostase celular, o que estimula futuros estudos para a caracterização detalhada do mecanismo de ação dessa proteína.