Avaliação in vitro da atividade imunomoduladora e anti-apoptótica do miglustato na osteoartrite

Abstract

A osteoartrite (OA) é uma doença reumática que atinge as articulações. Sua fisiopatologia é caracterizada pela degradação da cartilagem e apoptose dos condrócitos, através da ação de mediadores inflamatórios, como a IL-1β, a IL-6 e o TNF-α. As citocinas IL-16, IL-18, IL-22 e IL-31 têm sido apontadas como possíveis participantes dos mecanismos da OA. A depleção dos glicolipídeos é uma rota de estudo da inibição da apoptose dos condrócitos e do favorecimento do reparo da cartilagem. O miglustato, utilizado no tratamento de doenças de deposição lisossomal, inibe a enzima responsável pela síntese dos glicolipídeos e também é capaz de modular a secreção de citocinas e de inibir a apoptose em células de Purkinje. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a atividade imunomoduladora e anti-apoptótica do miglustato na osteoartrite. Foram recrutados 78 pacientes e 83 voluntários sadios. O soro foi obtido para dosagem de IL-16, IL-18, IL-22 e IL-31 por ELISA e o sangue total de 23 pacientes foi obtido para a cultura de PBMCs, posteriormente estimuladas com PMA/ionomicina e cultivadas por 24h com o miglustato nas concentrações de 10, 50 e 100 μM. O sobrenadante das culturas foi coletado para dosagem de IL-1β, IL-6 e TNF-α, através de CBA em citômetro de fluxo. Para estabelecimento da cultura primária de condrócitos, ratos Wistar foram eutanasiados e submetidos a cirurgia de remoção da cartilagem. As amostras foram incubadas overnight em meio DMEM contendo 3 mg/ml de colagenase tipo II; as células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com SBF a 10%; foi realizada uma imunofluorescência do receptor CD44 e do colágeno tipo II, a fim de confirmar o isolamento das células. Em seguida, foi feito um teste de citotoxicidade do miglustato nas concentrações citadas anteriormente. As células foram estimuladas com IL-1β a 1 ng/ml e miglustato e, decorrido um período de 48 horas, foram fixadas para imunofluorescência da caspase 3 e da Bcl-2. Setenta e quatro pacientes eram do sexo feminino e apenas 4 do sexo masculino, sendo a média de idade entre eles igual a 59,1 anos; 51,2% dos pacientes tinham OA de joelho, 78,2% apresentavam dor e 70,5% mostravam sinais como crepitação e nódulos; a maioria (80,4%) possuía comorbidades e mais da metade (53,8%) estava sob tratamento farmacológico. Os níveis séricos da IL-18 se mostraram significativamente elevados (p<0,0001) nos pacientes se comparados ao grupo controle, ao passo que a quantificação de IL-16, IL-22 e IL-31 foi maior nos voluntários sadios (p<0,0001, p = 0,0285 e p = 0,0005, respectivamente). A concentração das citocinas no soro não mostrou correlação com os parâmetros clínicos avaliados. Adicionalmente, o miglustato não inibiu significativamente a produção das citocinas. Os condrócitos mostraram marcação positiva para o CD44 e para o colágeno tipo II e se mantiveram viáveis no teste de citoxicidade em todas as doses. O miglustato foi capaz de reduzir expressivamente a marcação da caspase 3 e aumentar a da Bcl-2, indicando a redução da atividade apoptótica dos condrócitos.