Purificação, caracterização e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina de folhas de Portulaca elatior

Abstract

Lectinas são proteínas de origem não-imunológica capazes de se ligar de forma seletiva e reversível a carboidratos, sendo amplamente difundidas na natureza e possuindo diversas aplicações biológicas, como atividade antimicrobiana. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar uma lectina de folhas de Portulaca elatior (PeLL, P. elatior leaf lectin) e avaliar sua atividade antimicrobiana. As folhas de P. elatior foram secas, trituradas e homogeneizadas em NaCl 0,15 M (5%, p/v) durante 6 h para obtenção do extrato bruto (EB). O EB foi submetido à cromatografia em coluna de quitina, previamente equilibrada com NaCl 0,15 M. PeLL foi eluída com ácido acético 1,0 M, dialisada para remoção do eluente e avaliada quanto à atividade hemaglutinante (AH) e concentração de proteínas. A lectina foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas (PAGE) e desnaturantes (SDS-PAGE). A especificidade de ligação foi determinada por meio da incubação de PeLL com carboidratos e glicoproteínas anteriormente ao ensaio de AH. Estabilidade da AH de PeLL frente ao aquecimento e variação de pH também foi avaliada. Adicionalmente, o efeito de cátions divalentes na AH de PeLL foi determinado. No ensaio de atividade antimicrobiana, foram utilizadas as leveduras Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis e as bactérias fitopatogênicas Pectobacterium carotovorum brasiliensis, Pectobacterium carotovorum e dois outros isolados de Pectobacterium sp. As concentrações mínima inibitória (CMI), mínima fungicida (CMF) e mínima bactericida (CMB) foram determinadas através do ensaio de microdiluição em caldo. EB apresentou concentração proteica de 4,55 mg/mL e AH específica de 0,439. As proteínas do extrato foram fracionadas com sulfato de amônio em diferentes saturações, no entanto as frações obtidas (precipitadas e sobrenadantes) não apresentaram AH. Na etapa cromatográfica utilizando o EB, o pico de proteínas adsorvidas e eluídas com ácido acético apresentou AH específica de 744,2 (fator de purificação de 1.695 vezes) e foi denominado PeLL. PeLL se apresentou como uma única banda polipeptídica em PAGE para proteínas nativas ácidas e não apresentou nenhuma banda em PAGE para proteínas básicas. SDS-PAGE revelou PeLL como uma única banda de massa molecular de aproximadamente 20 kDa. A AH de PeLL foi inibida principalmente por albumina sérica bovina, manose e galactose. A AH de PeLL não foi alterada pelo aquecimento por 30 min em temperaturas de até 100 ºC. Quando fervida por diferentes períodos, PeLL apresentou redução da AH somente após 5 h de incubação. 8 A lectina demonstrou ser mais ativa em faixa de pH ácido; por outro lado, a AH foi reduzida em pH 8 e 12 e não foi detectada em pH 7, 9, 10 e 11. PeLL não teve sua AH influenciada pela presença dos cátions Mg2+ e Ca2+ , mas teve sua AH parcialmente inibida por íons Mn2+. PeLL apresentou CMI de 0,185 µg/mL e CMB de 0,74 µg/mL para todas as bactérias testadas. Para as leveduras, foi determinado CMI de 1,48 µg/mL para C. albicans, C. krusei e C. tropicalis; já para C. parapsilosis foram obtidos CMI e CMF de 0,74 e 2,96 µg/mL, respectivamente. Análise por citometria de fluxo indicou que PeLL induz apoptose das células de Candida albicans. Em conclusão, uma nova lectina termestável e com atividade antimicrobiana foi isolada a partir do extrato de folhas de P. elatior.