Uso de pontos quânticos para análise da atividade in vitro do inibidor de bomba de efluxo carbonil cianeto-3-clorofenilhidrazona sobre a formação de biofilme e perfil de susceptibilidade de isolados clínicos de Pseudomonas aeruginosa

Abstract

Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria Gram-negativa responsável por causar infecções oportunistas em pacientes imunocomprometidos. Os sistemas de efluxo multidroga são importantes para o surgimento de fenótipos multidroga-resistentes (MDR), que tem dificultado o tratamento das infecções por P. aeruginosa. O presente estudo teve como objetivo analisar a ação do inibidor de bomba de efluxo carbonil cianeto-3-clorofenilhidrazona (CCCP) frente a isolados clínicos de P. aeruginosa multidroga-resistentes provenientes de hospitais pernambucanos. Oito isolados MDR foram selecionados para o estudo, obtidos dos laboratórios de bacteriologia de três hospitais diferentes: um Hospital Universitário (UH), um Hospital terciário (TH) e um Hospital oncológico (CH), entre 2006 e 2017. Os isolados foram estocados no Laboratório de Bacteriologia e Biologia Molecular (LBBM) do Departamento de Medicina Tropical da Universidade Federal de Pernambuco. Reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada para pesquisa dos genes mexA e mexE codificantes da proteína canal dos sistemas de efluxo MexAB-OprM e MexEF-OprN, além dos genes codificantes de enzimas beta-lactamases blaᴋᴘᴄ, blasᴘᴍ e blaɢᴇs. O método de disco-difusão determinou os perfis de susceptibilidade para sete antimicrobianos diferentes na ausência e na presença de CCCP. As concentrações inibitórias mínimas (CIMs) para amicacina, meropenem e polimixina B foram obtidas através de microdiluições na ausência e na presença de CCCP. Um isolado foi selecionado para realização de microscopia de fluorescência após incubação com um bioconjugado de pontos quânticos de CdTe/meropenem na ausência e na presença do CCCP. Encontramos os genes mexA e mexE simultaneamente em todos os isolados analisados. Os genes blaᴋᴘᴄ, blasᴘᴍ₋₁ e blaɢᴇs também foram detectados (dois, um e três isolados, respectivamente) não havendo simultaneidade desses genes numa mesma bactéria. A adição do CCCP ocasionou aumento do halo de inibição em dois isolados, o primeiro para o imipenem (12 mm para 22 mm), o segundo isolado para ticarcilina/clavulanato e aztreonam (0 mm para 10 mm e 10 mm para 18 mm, respectivamente). Um terceiro isolado apresentou colônias crescidas no interior dos halos de inibição indicativas da presença do fenômeno de heterorresistência, essas colônias supostamente heterorresistentes desapareceram após a adição do CCCP para os antibióticos cefepime, aztreonam, gentamicina e ciprofloxacina. Após adição do CCCP dois isolados alteraram as CIMs para amicacina (128 µg/mL para 64 µg/mL e mais de 256 µg/mL para 32 µg/mL), para meropenem, um isolado diminuiu a CIM (32 µg/mL para 16 µg/mL) e outro aumentou (8 µg/mL para 16 µg/mL). Quanto à polimixina B todos os isolados tiveram as CIMs diminuídas na presença do inibidor sendo quatro isolados de 4 µg/mL para 2 µg/mL, três de 8 µg/mL para 4 µg/mL e um de 4 µg/mL para 1 µg/mL. A análise através de microscopia de fluorescência do bioconjugado de pontos quânticos com meropenem demonstrou diminuição na formação de biofilme e alteração no perfil de marcação da bactéria após adição de CCCP. Esses resultados sugerem que o CCCP pode ser apontado como um novo potencial agente usado em sinergia com os antibióticos para o tratamento de infecções por P. aeruginosa, além de poderem ser determinantes de resistência antimicrobiana através de sistemas de efluxo.