Purificação, caracterização e utilização de protease de Mytella charruana (Bivalvia: Mytilidae) na obtenção de peptídeos antimicrobianos

Abstract

Proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas de maneira seletiva, o que resulta na degradação de proteínas. Essas enzimas são amplamente utilizadas na indústria nas indústrias química, farmacêutica e de alimentos, por exemplo, por apresentarem diversas aplicações biotecnológicas. Na sua estrutura nativa, proteínas de reserva geralmente não apresentam nenhuma atividade antimicrobiana, mas quando degradadas por proteases podem liberar peptídeos bioativos com ação antimicrobiana. Os objetivos da presente dissertação foram purificar e caracterizar uma protease a partir da massa visceral do mexilhão Mytella charruana (denominada MycP, do inglês M. charruana protease) e avaliar sua capacidade de hidrolisar caseína de leite e gerar peptídeos antimicrobianos. A massa visceral de M. charruana foi homogeneizada com Tris-HCl 0,1M pH 8,0 e, após centrifugação, o extrato foi avaliado quanto à atividade proteolítica total. O efeito de inibidores de protease foi avaliado. MycP foi isolada através de cromatografia de gel filtração (Sephadex G-75) seguida de cromatografia de troca iônica (DEAE-Sephadex A25). A protease foi submetida à focalização isoelétrica e SDS-PAGE e avaliada quanto à atividade tripsina-símile. O efeito do pH e temperatura na atividade tripsina-símile foi determinado. MycP foi utilizada para realizar a hidrólise da caseína e o hidrolisado foi avaliado quanto à atividade antibacteriana contra Escherichia coli, Bacillus subtilis, Klebsiella pneumoniae e Micrococcus luteus, e atividade antifúngica contra Candida albicans, Candida tropicalis e Candida krusei. O extrato da massa visceral teve sua atividade proteolítica inibida em 55%, 59% e 24%, respectivamente, indicando a presença de aspártico, serino e metalo proteases. MycP apresentou pI 4,1 e uma única banda polipeptídica de 83,1 kDa em SDS-PAGE. MycP apresentou atividade semelhante à tripsina com temperatura ótima de 40ºC. Esta atividade foi estável numa ampla gama de pH (3,0-9,0). O Km relativo à atividade tripsina-símile de MycP foi 4,28±0,34 mM de BApNA e a Vmáx foi 0,056 ± 0,001 nmol de BApNA/min. MycP foi capaz de promover a hidrólise de caseína e o hidrolisado foi capaz de inibir o crescimento de Escherichia coli, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniae com MIC de 5,0 μg/mL para todas essas bactérias. Não foi detectada atividade antifúngica contra as espécies de Candida testadas. Em conclusão, a massa visceral de M. charruana contém uma protease com atividade tripsina-símile capaz de gerar peptídeos com efeito bacteriostático derivados da hidrólise da caseína.