Utilização de um repórter fluorescente para a avaliação funcional de fatores envolvidos na iniciação da tradução de tripanossomatídeos

Abstract

Os tripanossomatídeos são parasitas flagelados causadores de diversas doenças humanas e que apresentam algumas características moleculares bem distintas. Nestes organismos, o controle da sua expressão gênica é quase exclusivamente pós-transcricional e dados obtidos até o momento sugerem que a etapa de iniciação da tradução tem um papel importante neste controle. Durante a iniciação da tradução de eucariotos, o complexo trimérico eIF4F (formado pelas subunidades eIF4A, eIF4G e eIF4E) tem uma participação importante no reconhecimento do mRNA, facilitando o recrutamento ribossomal para iniciar a síntese proteica. Múltiplos homólogos das subunidades do complexo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos, mas não foi possível elucidar a função específica de cada um deles. Desta forma, este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de um ensaio in vivo para a avaliação do efeito da superexpressão desses homólogos de Trypanosoma brucei na tradução de um mRNA repórter, o qual codifica a proteína GFP (green fluorescent protein). Três linhagens repórter foram obtidas (4212, 4213 e 4235) e sete homólogos das subunidades do complexo eIF4F e um de PABP foram testados nestas linhagens. A análise da superexpressão foi feita através de ensaios de Western blot, seus perfis de crescimento foram avaliados por curvas de crescimento e a expressão de GFP foi avaliada através de citometria de fluxo. Os resultados apresentados mostram que as linhagens repórter 4213 e 4235 são viáveis para serem utilizadas na caracterização das proteínas envolvidas no controle da expressão gênica de tripanossomatídeos. Foi observado que as proteínas EIF4E1 e EIF4E2 provocam diminuição do crescimento, enquanto a superexpressão de EIF4E3, EIF4E4, EIF4E4W279A, EIF4G3, EIF4G4 e PABP1 não alteram o crescimento celular dos parasitas. Apesar da detecção de variações na expressão de GFP durante a superexpressão de alguns dos homólogos testados, não foi possível, contudo, confirmar que estas proteínas aumentam ou diminuem a tradução. Ensaios complementares ainda precisam ser feitos para confirmar a real função destes.