Quimiluminescência utilizando lectinas conjugadas a éster de acridina na avaliação histoquímica de tumores cutâneos e da interação lectina-carboidrato

Abstract

Com o objetivo de criar um modelo biológico reprodutível e eficiente que possa mimetizar a interação proteína-carboidrato, nós reportamos o uso do ensaio quimiluminescente com lectinas conjugadas a éster de acridina (EA) para investigar a complexação da lectina ao carboidrato e para avaliação quantitativa da expressão de carboidratos em tumores cutâneos. Polissacarídeos de N-acetil-D-glicosamina (quitosana), glicose (phytagel) e galactose (carragenana) foram utilizados para sintetizar membranas (0,0314 – 0,6358 cm2). Concanavalina A-EA (Con A), Wheat germ aglutinina (WGA), Peanut aglutinina (PNA), Ulex europeaus aglutinina-I (UEA-I) e Maackia amurensis aglutinina (MAA) foram conjugadas a EA. A atividade hemaglutinante das lectinas-EA foi avaliada e a quimiluminescência quantificada e expressa em Unidades Relativas de Luz (URL). Biópsias de pele normal e de tumores cutâneos, tais como ceratose actínica (AK), ceratoacantoma (KA), carcinoma espinocelular (CEC) e basocelular (CBC), e as membranas foram incubadas com o conjugado lectina-EA (100 μL 100 μg mL-1) por 2h a 4°C. A emissão de fótons foi quantificada e correlacionada com a marcação de tecidos normais, transformados e das membranas. Inibições com carboidratos específicos foram realizadas. AK, KA , CBC e CEC apresentaram menor expressão de α -D- glucose/manose e resíduos de α-L-fucose, em comparação com o tecido normal. Os tumores cutâneos apresentaram maior expressão resíduos de β Gal-(1-3)-GalNAc que o tecido normal . AK e SCC exibiram maior expressão de resíduos Neu5Ac-α(2,3)Gal que a epiderme normal. KA e BCC apresentaram valores de URL equivalentes, em comparação com o tecido normal. Os valores de URL diminuíram quando as lectinas foram incubadas com seus carboidratos específicos. Os valores das constantes e os sítios de ligação foram calculados para cada lectina utilizando a equação obtida a partir das curvas hiperbólicas, 2,4 x 10-7 M-1 ± 0,8 x 10-7 M-1and 1,3 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,3 x 10-3 mol . mg-1 (Con A); 0,9 x 10-6 M-1  0,4 x 10-6 M-1 and 0,021 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,003 x 10-3 mol . mg-1 (WGA) and 2,0 x 10-6 M-1  0,9 x 10-6 M-1 and 0,069 x 10-3 mol . mg-1 ± 0,010 x 10-3 mol . mg-1 (PNA). O método quimiluminescente permitiu a avaliação quantitativa direta da expressão de carboidratos em neoplasias de pele e a investigação a complexação da lectina ao carboidrato através do modelo de Langmuir, combinando a especificidade desta interação e a sensibilidade dos ensaios quimiluminescentes.