Investigação do caule do Xique-xique (Pilosocereus gounellei) como fonte de inibidor de tripsina com ação antibacteriana

Abstract

Proteínas antimicrobianas que inibem proteases constituem antibióticos promissores e, adicionalmente, não apresentam como limitação a sensibilidade à proteólise. O xiquexique (Pilosocereus gounellei) é um cacto que cresce nas áreas secas, sendo endêmico da região semi-árida brasileira. A presente dissertação teve como objetivo purificar um inibidor de tripsina (PgTI, do inglês P. gounellei trypsin inhibitor) a partir do caule de P. gounellei e avaliar sua atividade antibacteriana contra espécies patogênicas ao homem. O caule de P. gounellei foi coletado na cidade de Limoeiro (Pernambuco) e, após a remoção dos espinhos, foi cortado em pequenas peças e posto para secar por 3 dias a 28 ºC. Em seguida, o material foi triturado em multiprocessador e a farinha resultante (5 g) foi homogeneizada com NaCl 0,15 M (100 mL) por 16 h a 28 ºC. Após centrifugação (3.000 g, 15 min), o extrato foi coletado e cromatografado em coluna de Sephadex G-100. Fração proteica (P1) obtida nessa etapa foi então avaliada quanto à atividade inibidora de tripsina e concentração de proteínas. Em seguida, P1 foi submetida à cromatografia de troca iônica em coluna DEAE-FF 16/10 acoplada ao sistema ÄKTAprimeTM (GE Healthcare). PgTI foi eluído com NaCl 1,0 M e, após diálise, foi avaliado quanto à atividade inibidora de tripsina, ao perfil em eletroforese bidimensional e à estabilidade de sua atividade inibidora frente ao aquecimento. Os efeitos de PgTI sobre o crescimento e sobrevivência de Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Micrococcus luteus, Pseudomonas aeruginosa, Serratia sp., Staphylococcus aureus e Staphylococcus saprophyticus foram avaliados através da determinação das concentrações mínima inibitória (CMI) e mínima bactericida (CMB). O extrato do caule de xiquexique apresentou alta viscosidade, impossibilitando a avaliação da atividade inibidora de tripsina e a dosagem de proteínas. Cromatografia do extrato em coluna de gel filtração (Sephadex G-100) foi então utilizada para se obter preparação proteica (P1) livre de viscosidade, a qual apresentou atividade inibidora de tripsina de 184 U/mg. PgTI foi obtido por cromatografia de P1 em coluna de troca iônica, tendo apresentado atividade inibidora de tripsina de 373 U/mg (fator de purificação: 2,02). Eletroforese bidimensional revelou PgTI como um único spot, de 37,1 kDa e PI 5,88. PgTI apresentou Ki de 14 nM para tripsina bovina e foi estável ao aquecimento até 50 °C, mas teve sua atividade abolida quando aquecido a 60 °C. PgTI inibiu o crescimento de E. coli, E. faecalis, M. luteus, P. aeruginosa, Serratia sp., S. aureus e S. saprophyticus (CMI: 37,5, 150, 37,5, 18,7, 7,5, 7,5 e 18,7 μg/mL, respectivamente), sendo bactericida somente para E. coli (CMB: 75 μg/ml). Em conclusão, o caule do xiquexique contém um inibidor de tripsina (PgTI) com atividade antibacteriana contra espécies de importância médica.