Caracterização estrutural dos locos CRISPR em cepas brasileiras de Yersinia pestis

Abstract

Yersinia pestis é o agente causador da peste, doença primária de roedores transmitida por pulgas, que pode afetar o homem e outros mamíferos. A subtipagem molecular das cepas de Y. pestis tem sido dificultada pela grande similaridade genética entre os isolados. A análise dos locos CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) trouxe avanços em estudos filogenéticos e tipagem de cepas de Y. pestis dos numerosos focos dos diversos países. O objetivo deste trabalho foi avaliar a diversidade intraespecífica em cepas brasileiras de Y. pestis através do estudo dos locos CRISPR. As três sequências CRISPR (YPa, YPb e YPc) reconhecidas da Y. pestis foram amplificadas nas 98 cepas analisadas, originadas de diferentes fontes, focos e momentos epidemiológicos. Os amplicons obtidos por PCR foram analisados em gel de agarose e sequenciados. O loco YPa se mostrou o mais polimórfico, apresentando seis alelos de 449 a 630 pares de base (pb), seguido pelo YPb, com quatro alelos de 271 a 392 pb. O loco YPc, monomórfico, apresentou apenas um alelo de 331 pb em toda as cepas. Foi observado que as repetições diretas (DRA) são compostas de 28 pb, separadas por sequências espaçadoras únicas de 32 ou 33 pb em todos os locos. Dos 137 espaçadores já conhecidos 18 foram encontrados nas cepas analisadas e, adicionalmente, 19 novos espaçadores foram observados, 15 no loco YPa e quatro no loco YPb. A análise da distribuição dos espaçadores definiu 20 perfis genotípicos, refletindo a diversidade intraespecífica das cepas brasileiras, e evidenciou uma correlação entre a presença de alguns conjuntos de sequências espaçadoras e os focos de origem das cepas. A maioria dos perfis é exclusiva de uma cepa de um foco, e alguns são dispersos em vários focos e períodos. As incorporações/perdas de motivos observadas nos locos YPa e YPb sugerem que estes estão ativos e a ausência de alterações no loco YPc sugere inatividade. Em conclusão, a análise dos locos CRISPR revelou heterogeneidade e identificou características genéticas exclusivas nas cepas brasileiras que podem ser atribuídas à microevolução da bactéria após sua introdução no país.