Isolamento de gene de defensina em Euphorbia hyssopifolia L., caracterização in silico, propriedades químicas e função putativa da proteína codificada

Abstract

Plantas possuem complexos e eficientes mecanismos de defesa contra diversos agentes patogênicos, dentre eles a ativação transcricional de numerosos genes, como os responsáveis pela produção de peptídeos antimicrobianos, incluindo as defensinas. Tratamse de proteínas pequenas (ca. 5 kDa), básicas e ricas em cisteína, que fazem parte do sistema de defesa desses organismos. Euphorbia hyssopifolia L. é uma erva daninha amplamente empregada na medicina popular brasileira, indiana e asiática, destacandose pela sua atividade antimicrobiana, a qual, juntamente com seu potencial invasor e sua natural resistência a patógenos, a tornam uma boa candidata para a pesquisa dessas proteínas. O potencial para uso de defensinas vegetais como novas substâncias terapêuticas reside na similaridade estrutural com defensinas de mamíferos; seu amplo espectro antimicrobiano; sua atividade rápida e em baixas doses; no sinergismo com outras defensinas e esquemas terapêuticos. Além disso, podem inativar endotoxinas; e o desenvolvimento de resistência é improvável. Defensinas exibem baixa toxicidade em células de mamíferos e podem modular resposta imune inata em mamíferos. O presente projeto objetivou isolar um gene codificante de defensinas em E. hyssopifolia via genética molecular, analisar sua sequência de nucleotídeos e a de aminoácidos traduzidos, verificando a similaridade com as defensinas de outros organismos, além de modelar tridimensionalmente e predizer as propriedades químicas e caracterizar estruturalmente a proteína putativa obtida. Os fragmentos amplificados por PCR a partir do DNA genômico foliar de E. hyssopifolia foram purificados e clonados em vetor plasmidial inserido em células de Escherichia coli, para sequenciamento. Para a análise in silico da sequência, foram empregados os programas fGenesh; BLAST; Dissulfind; Philius; APD2 Predictor e ProtParam. A modelagem de homologia 3D foi gerada e editada usando o programa Modeller e a estrutura da defensina foi visualizada no Jmol Viewer. A sequência do gene obtida foi de 361 pb dispostos em um íntron e dois éxons. Um pró-peptídeo com 78 aminoácidos foi gerado a partir da sequência codificante, que apresentou 237 pb. O peptídeo maduro compreendeu 47 aminoácidos e obedeceu ao motivo alfa-beta estabilizado por cisteínas (CSαβ) descrito para defensinas. As sequências de nucleotídeos e aminoácidos de E. hyssopifolia exibiram alta homologia com sequências de defensinas vegetais disponíveis em bancos de dados. As sequências codificantes (CDS) mostraram indícios de seleção negativa. Ainda, os preditores de propriedades químicas exibiram condizentes com defensinas. A estrutura tridimensional também foi caracterizada quanto à presença de pontes dissulfeto, hidrofobicidade, potencial eletrostático e acessibilidade ao solvente. Assim, o projeto contribuiu para conhecimento de uma nova defensina vegetal com potencial para o desenvolvimento de novos produtos farmacêuticos.