Produção de proteases com atividade fibrinolítica por fungos filamentosos de solos da caatinga utilizando fermentação em estado sólido

Abstract

Enzimas fibrinolíticas têm recebido atenção, devido ao seu potencial medicinal para doenças trombolíticas, estas estão se tornando uma das principais causas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Este trabalho teve como finalidade obter condições de produção e caracterização de proteases fibrinolítica, produzida por fungos filamentosos isolados de solo da Caatinga-PE-Brasil, utilizando fermentação em estado sólido, e purificar essa enzima utilizando Sistema de Duas Fases Aquosas. Dentre os fungos estudados, foi selecionado o Mucor subtillissimus SIS42 como melhor produtor da protease e entre os resíduos agroindustriais utilizados, o melhor substrato foi o farelo de trigo. Através de um planejamento fatorial 23 as condições otimizadas de produção foram: 3g de farelo de trigo, 50% de umidade, submetidos a 25ºC após 72 horas de fermentação, com uma atividade fibrinolítica e proteásica de 144,58 U/mL e 48,33 U/mL, respectivamente. A protease fibrinolítica contida no extrato bruto apresentou uma temperatura ótima de 45ºC e foi estável nesta temperatura por 150 minutos, a mesma teve sua atividade proteásica aumentada na presença de K+, Ca+ e Mn+ e diminuída na adição de Cu+. De acordo com a especificidade a substratos cromogênicos e a presença de PMSF, esta enzima foi classificada como uma serino protease do tipo quimiotrispsina. A partir dos resultados obtidos, foi realizado um planejamento experimental (23) para purificação da protease fibrinolítica produzido pelo M. subtillissimus SIS42 utilizando o sistema de duas fases aquosas, onde foi possível avaliar a influência das variáveis: concentração e massa molar do PEG e concentração de sulfato de sódio na purificação da enzima. Três variáveisrespostas foram avaliadas (coeficiente de partição, recuperação da enzima e fator de purificação). Utilizando um planejamento central composto para ampliar os estudos e efeitos na purificação da enzima, foram estudadas as variáveis: concentração de PEG (6000 g/mol) e sulfato de sódio. Os resultados atingidos foram: coeficiente de partição para a fase rica em sal (0,049 a 0,795), um aumento de pureza de 10 com uma recuperação de 102% da atividade enzimática na fase inferior do sistema. O sistema que proporcionou as melhores condições de purificação foi constituído por: PEG 6000 (g/mol) e concentração de 30,00% (m/m) com uma concentração de sulfato de sódio de 13,20% (m/m). A protease fibrinolítica apresentou através de uma SDS-PAGE uma massa massa molar após a purificação de 94kDa e atividade no zimograma de fibrina. Após a purificação, por sistema de duas fases aquosas a protease fibrinolítica foi novamente avaliada a presença de PMSF e a substratos cromogênicos, indicando a enzima como uma quimiotripsina.